中华圆田螺活性蛋白的纤溶活性探析

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中华圆田螺活性蛋白的纤溶活性探析

　摘　　　　要：　纤溶活性蛋白研究是当前研究之一,　该蛋白具有良好的溶栓效果。中华圆田螺富

含活性蛋白。本实验以中华圆田螺为研究对象,　采用硫酸铵分段盐析分离和提取得到了活性粗

蛋白。纤溶平板法证明其具有纤溶活性,　并研究了温度、pH 值、金属离子对其纤溶活性的影

响。实验结果表明中华圆田螺活性蛋白最适作用温度为 58℃;pH 值为 7～10 范围内影响较小,　

活性较强;Na+、K+对其纤溶活性无影响,　Ca2+、Fe3+对其有抑制作用。

　　　 0　、引言

由于蛋白质控制体内重要的生理活动,　人们一直在研究蛋白质的生物作用机理。随着科学技术

的发展,　蛋白质的研究越来越深入,　一些特殊蛋白质的生物学有了新的发展。而且一些动植物蛋

白开始应用到人类的生产、医疗等方面。

中华圆田螺是属于软体动物门、腹足纲、田螺科、圆田螺属。国内主要分布于南方各省区,　国

外分主要布在北美等地。它的繁殖能力强,　生长速度快,　食性范围广,　肉质鲜美。螺肉营养价值

很高,　主要是蛋白质很丰富,　另外还有磷、钙、铁、维生素 B,　以及丰富的维生素 A等,　属于高蛋

白低脂肪的一类食品。中华圆田螺常以水生植物和低等藻类为食,　体内可能富含纤溶酶等酶。

同时中华圆田螺的个头较大,　生长迅速,　而它体内富含的纤溶活性蛋白极具医药价值,　具有较大

的经济意义。目前有一些研究发现,　某些纤溶活性蛋白具有较好的溶栓效果,　与此同时还具有对

许多肿瘤细胞的抑瘤作用[1,2]。当前的药物已经无法满足人类的需求,　人类社会急需开发新的

具有高效、无毒的药物,　而纤溶活性蛋白[4,5]、多肽等物质将会是未来研究的重要方向。

1 　、材料及方法

　　　 1.1 　、试验材料

　　　 1.1.1　、原料与试剂

中华圆田螺:南昌水产品综合市场购买;磷酸二氢钠:天津市大茂化学试剂厂;磷酸氢二钠:天津市

大茂化学试剂厂;硫酸铵:天津市福晨化学试剂厂; 　三(羟甲基)　氨基甲烷试剂:天津市大茂化学试

剂厂。

盐酸:西陇化工股份有限公司;氢氧化钠:西陇化工股份有限公司;甘氨酸:天津市大茂化学试剂厂;

　乙二胺四乙酸二钠 (EDTA)　:天津市大茂化学试剂厂;氯化钡:上海山浦化工有限公司;聚乙二醇

8000:实验试剂;氯化钠:天津市大茂化学试剂厂;D34mm 透析袋:进口;氯化钾:天津市大茂化学试

剂厂;无水氯化钙:天津市大茂化学试剂厂;BME　(巯基乙醇)　:西陇化工股份有限公司;三氯化铁:西

陇化工股份有限公司;琼脂糖:GENE　COMPANGY;尿激酶:生化试剂;考马斯亮蓝 G-250:上海蓝季

科技发展有限公司;牛血清蛋白:冻干粉,　北京索莱宝科技有限公司以上试剂均为分析纯。

1.1.2 　、仪器与设备

组织捣碎机:上海精科仪器有限公司;JB-2 型恒温磁力搅拌器:上海雷磁新泾仪器有限公

司;AUY220 电子分析天平:梅特勒-上海;高速冷冻离心机: 　热电 (上海)　科技仪器有限公司;DHG-

9076A 型电热型恒温鼓风干燥箱:上海精宏实验设备有限公司;WFZ—UV-2000 型紫外可见分光

光度计: 　尤尼柯 (上海)　仪器有限公司;微量移液器:德国Eppendorf 公司;生化培养箱:上海博迅实业

有限公司。

　 1.2 　、实验方法

　　　 1.2.1　、总蛋白的提取

将中华圆田螺洗净,　破壳取螺肉组织,　高速组织捣碎机进行捣碎。加入5 　倍中华圆田螺重量体积

(V/W)　的磷酸盐缓冲液,　预冷后,　磁力振荡搅拌器搅拌 20min,　4℃浸提过夜。先用纱布过滤浸提

液除去大块的螺肉,　滤液在4℃下5000r/min 离心20min,　取上清液,　即中华圆田螺粗提液,　并测量

液体体积[3]。

采用硫酸铵溶液饱和的方法,　分段盐析分别以30%、65%、90%的盐饱和度进行盐析。在 25℃

下,　30%硫酸铵饱和度需要加入176g/L 的硫酸铵质量,　加入到中华圆田螺粗提液中,　4℃预冷,　通

过磁力振荡搅拌器搅拌 20min 后使硫酸铵完全溶解,　4℃下静置 1h 后,　再在4℃条件

下10000r/min 离心20min,　沉淀可以用 3倍体积的磷酸盐缓冲液溶解,　收集上清液用量筒测量体

积。采用同样的方法进行盐析,　65%硫酸铵饱和度需要加入235g/L 的硫酸铵质量,　而90%硫酸铵

饱和度需要加入190g/L 的硫酸铵质量。各盐析段的沉淀的溶解溶液4℃保存,　备用。各盐析段

的沉淀的溶解溶液分别装入到事先处理过的透析袋中,　用蒸馏水透析5h 后,　再用Tris-HCl 缓冲

液透析,　定时换缓冲液透析,　直到用氯化钡溶液检测不出白色的硫酸钡沉淀为止[6]。透析结束后

的透析袋放到固体聚乙二醇8000 中进行浓缩,　浓缩完后将透析袋中待测液 4℃保存,　备用。用过

的透析袋先用蒸馏水洗干净,　然后用沸水煮沸 8min,　最后放入蒸馏水中,　冰箱中保存可以供再次

使用。聚乙二醇在烘干箱中干燥可以再次利用。

1.2.2　、纤维蛋白活性测定

首先将0.3g 琼脂糖先溶于 36mL 　磷酸盐缓冲液 (PBS,　pH=7.6)　中,　煮沸后琼脂溶解,　45℃左右,　加

入1.5mL 　纤维蛋白原溶液(10mg/mL)　和60uL 　凝血酶(100u/mL)　溶液,　混匀后迅速倒入45℃预热

培养皿,　在室温下静置 30min,　等到平板完全凝固后,　置4℃冰箱备用。

1.2.3　、纤维活性蛋白含量测定

用8根10mL 比较干净的试管,　按下表2-1 取样,　溶液混匀后,　放置 2min 后用比色杯在280nm 波

长下,　用分光光度度计测量,　记录各管测定的光密度A280nm,　分别以吸光度为纵坐标,　蛋白质浓

度为横坐标作图。

取未知浓度的样品蛋白液40μL,　加蒸馏水3.96mL,　测A280nm 条件下的吸收系数,　对照标准曲线

求得蛋白质溶度。

表1　 ——紫外吸收法测定蛋白质浓度标准曲线制作

1.2.4 　、物化因子对中华圆田螺活性蛋白的影响

　　　 1.2.4.　1 　、金属离子、变性剂和抑制剂对田螺活性蛋白的影响

按表4配制出1mol/L 的NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、FeCl3 　、巯基乙醇(BME)　试剂分别与等

量的样品溶液混合均匀后,　通过纤维蛋白平板法测定其酶活力。

　 1.2.4.　2　、温度和 pH 对田螺活性蛋白的影响

把样品溶液分别置于8 　组(20～70℃)　温度下处理30min 后,　用纤维蛋白平板法测定其酶活力。

把样品溶液和6组不同的 pH 　值缓冲液 (p　H6～8的磷酸盐缓冲液,　pH8.5～10 的甘氨酸-NaOH 缓

冲液,　用NaOH 调节 pH10.5～11.5 的生理盐水)　等量混匀,　用纤维蛋白平板法测定其酶活力。

图1　中华圆田螺活性蛋白纤溶平板

1:PBS;2:BSA　(10mg/mL)　;3:UK　(160U/mL)　;4:30%MFP;5:65%MFP;6:90%MFP

　 2 　、结果及讨论

　　　 2.1　、纤溶活性的鉴定

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摘要：

中华圆田螺活性蛋白的纤溶活性探析　摘　　　　要：　纤溶活性蛋白研究是当前研究之一,　该蛋白具有良好的溶栓效果。中华圆田螺富含活性蛋白。本实验以中华圆田螺为研究对象,　采用硫酸铵分段盐析分离和提取得到了活性粗蛋白。纤溶平板法证明其具有纤溶活性,　并研究了温度、pH值、金属离子对其纤溶活性的影响。实验结果表明中华圆田螺活性蛋白最适作用温度为58℃;pH值为7～10范围内影响较小,　活性较强;Na+、K+对其纤溶活性无影响,　Ca2+、Fe3+对其有抑制作用。　　　0　、引言由于蛋白质控制体内重要的生理活动,　人们一直在研究蛋白质的生物作用机理。随着科学技术的发展,　蛋白质的研究越来越深入,　一些特...

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