中华圆田螺活性蛋白的纤溶活性探析
中华圆田螺活性蛋白的纤溶活性探析
摘 要： 纤溶活性蛋白研究是当前研究之一, 该蛋白具有良好的溶栓效果。中华圆田螺富
含活性蛋白。本实验以中华圆田螺为研究对象, 采用硫酸铵分段盐析分离和提取得到了活性粗
蛋白。纤溶平板法证明其具有纤溶活性, 并研究了温度、pH 值、金属离子对其纤溶活性的影
响。实验结果表明中华圆田螺活性蛋白最适作用温度为 58℃;pH 值为 7～10 范围内影响较小,
活性较强;Na+、K+对其纤溶活性无影响, Ca2+、Fe3+对其有抑制作用。
0 、引言
由于蛋白质控制体内重要的生理活动, 人们一直在研究蛋白质的生物作用机理。随着科学技术
的发展, 蛋白质的研究越来越深入, 一些特殊蛋白质的生物学有了新的发展。而且一些动植物蛋
白开始应用到人类的生产、医疗等方面。
中华圆田螺是属于软体动物门、腹足纲、田螺科、圆田螺属。国内主要分布于南方各省区, 国
外分主要布在北美等地。它的繁殖能力强, 生长速度快, 食性范围广, 肉质鲜美。螺肉营养价值
很高, 主要是蛋白质很丰富, 另外还有磷、钙、铁、维生素 B, 以及丰富的维生素 A等, 属于高蛋
白低脂肪的一类食品。中华圆田螺常以水生植物和低等藻类为食, 体内可能富含纤溶酶等酶。
同时中华圆田螺的个头较大, 生长迅速, 而它体内富含的纤溶活性蛋白极具医药价值, 具有较大
的经济意义。目前有一些研究发现, 某些纤溶活性蛋白具有较好的溶栓效果, 与此同时还具有对
许多肿瘤细胞的抑瘤作用[1,2]。当前的药物已经无法满足人类的需求, 人类社会急需开发新的
具有高效、无毒的药物, 而纤溶活性蛋白[4,5]、多肽等物质将会是未来研究的重要方向。
1 、 材料及方法
1.1 、 试验材料
1.1.1 、原料与试剂
中华圆田螺:南昌水产品综合市场购买;磷酸二氢钠:天津市大茂化学试剂厂;磷酸氢二钠:天津市
大茂化学试剂厂;硫酸铵:天津市福晨化学试剂厂; 三(羟甲基) 氨基甲烷试剂:天津市大茂化学试
剂厂。
盐酸:西陇化工股份有限公司;氢氧化钠:西陇化工股份有限公司;甘氨酸:天津市大茂化学试剂厂;
乙二胺四乙酸二钠 (EDTA) :天津市大茂化学试剂厂;氯化钡:上海山浦化工有限公司;聚乙二醇
8000:实验试剂;氯化钠:天津市大茂化学试剂厂;D34mm 透析袋:进口;氯化钾:天津市大茂化学试
剂厂;无水氯化钙:天津市大茂化学试剂厂;BME (巯基乙醇) :西陇化工股份有限公司;三氯化铁:西
陇化工股份有限公司;琼脂糖:GENE COMPANGY;尿激酶:生化试剂;考马斯亮蓝 G-250:上海蓝季
科技发展有限公司;牛血清蛋白:冻干粉, 北京索莱宝科技有限公司以上试剂均为分析纯。
1.1.2 、 仪器与设备
组织捣碎机:上海精科仪器有限公司;JB-2 型恒温磁力搅拌器:上海雷磁新泾仪器有限公
司;AUY220 电子分析天平:梅特勒-上海;高速冷冻离心机: 热电 (上海) 科技仪器有限公司;DHG-
9076A 型电热型恒温鼓风干燥箱:上海精宏实验设备有限公司;WFZ—UV-2000 型紫外可见分光
光度计: 尤尼柯 (上海) 仪器有限公司;微量移液器:德国Eppendorf 公司;生化培养箱:上海博迅实业
有限公司。
1.2 、 实验方法
1.2.1 、总蛋白的提取
将中华圆田螺洗净, 破壳取螺肉组织, 高速组织捣碎机进行捣碎。加入5 倍中华圆田螺重量体积
(V/W) 的磷酸盐缓冲液, 预冷后, 磁力振荡搅拌器搅拌 20min, 4℃浸提过夜。先用纱布过滤浸提
液除去大块的螺肉, 滤液在4℃下5000r/min 离心20min, 取上清液, 即中华圆田螺粗提液, 并测量
液体体积[3]。
采用硫酸铵溶液饱和的方法, 分段盐析分别以30%、65%、90%的盐饱和度进行盐析。在 25℃
下, 30%硫酸铵饱和度需要加入176g/L 的硫酸铵质量, 加入到中华圆田螺粗提液中, 4℃预冷, 通
过磁力振荡搅拌器搅拌 20min 后使硫酸铵完全溶解, 4℃下静置 1h 后, 再在4℃条件
下10000r/min 离心20min, 沉淀可以用 3倍体积的磷酸盐缓冲液溶解, 收集上清液用量筒测量体
积。采用同样的方法进行盐析, 65%硫酸铵饱和度需要加入235g/L 的硫酸铵质量, 而90%硫酸铵
饱和度需要加入190g/L 的硫酸铵质量。各盐析段的沉淀的溶解溶液4℃保存, 备用。各盐析段
的沉淀的溶解溶液分别装入到事先处理过的透析袋中, 用蒸馏水透析5h 后, 再用Tris-HCl 缓冲
液透析, 定时换缓冲液透析, 直到用氯化钡溶液检测不出白色的硫酸钡沉淀为止[6]。透析结束后
的透析袋放到固体聚乙二醇8000 中进行浓缩, 浓缩完后将透析袋中待测液 4℃保存, 备用。用过
的透析袋先用蒸馏水洗干净, 然后用沸水煮沸 8min, 最后放入蒸馏水中, 冰箱中保存可以供再次
使用。聚乙二醇在烘干箱中干燥可以再次利用。
1.2.2 、纤维蛋白活性测定
首先将0.3g 琼脂糖先溶于 36mL 磷酸盐缓冲液 (PBS, pH=7.6) 中, 煮沸后琼脂溶解, 45℃左右, 加
入1.5mL 纤维蛋白原溶液(10mg/mL) 和60uL 凝血酶(100u/mL) 溶液, 混匀后迅速倒入45℃预热
培养皿, 在室温下静置 30min, 等到平板完全凝固后, 置4℃冰箱备用。
1.2.3 、纤维活性蛋白含量测定
用8根10mL 比较干净的试管, 按下表2-1 取样, 溶液混匀后, 放置 2min 后用比色杯在280nm 波
长下, 用分光光度度计测量, 记录各管测定的光密度A280nm, 分别以吸光度为纵坐标, 蛋白质浓
度为横坐标作图。
取未知浓度的样品蛋白液40μL, 加蒸馏水3.96mL, 测A280nm 条件下的吸收系数, 对照标准曲线
求得蛋白质溶度。
表1 ——紫外吸收法测定蛋白质浓度标准曲线制作
1.2.4 、 物化因子对中华圆田螺活性蛋白的影响
1.2.4. 1 、 金属离子、变性剂和抑制剂对田螺活性蛋白的影响
按表4配制出1mol/L 的NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、FeCl3 、巯基乙醇(BME) 试剂分别与等
量的样品溶液混合均匀后, 通过纤维蛋白平板法测定其酶活力。
1.2.4. 2 、温度和 pH 对田螺活性蛋白的影响
把样品溶液分别置于8 组(20～70℃) 温度下处理30min 后, 用纤维蛋白平板法测定其酶活力。
把样品溶液和6组不同的 pH 值缓冲液 (p H6～8的磷酸盐缓冲液, pH8.5～10 的甘氨酸-NaOH 缓
冲液, 用NaOH 调节 pH10.5～11.5 的生理盐水) 等量混匀, 用纤维蛋白平板法测定其酶活力。
图1 中华圆田螺活性蛋白纤溶平板
1:PBS;2:BSA (10mg/mL) ;3:UK (160U/mL) ;4:30%MFP;5:65%MFP;6:90%MFP
2 、 结果及讨论
2.1 、纤溶活性的鉴定
摘要：
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中华圆田螺活性蛋白的纤溶活性探析 摘 要： 纤溶活性蛋白研究是当前研究之一, 该蛋白具有良好的溶栓效果。中华圆田螺富含活性蛋白。本实验以中华圆田螺为研究对象, 采用硫酸铵分段盐析分离和提取得到了活性粗蛋白。纤溶平板法证明其具有纤溶活性, 并研究了温度、pH值、金属离子对其纤溶活性的影响。实验结果表明中华圆田螺活性蛋白最适作用温度为58℃;pH值为7～10范围内影响较小, 活性较强;Na+、K+对其纤溶活性无影响, Ca2+、Fe3+对其有抑制作用。 0 、引言由于蛋白质控制体内重要的生理活动, 人们一直在研究蛋白质的生物作用机理。随着科学技术的发展, 蛋白质的研究越来越深入, 一些特...
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作者：闻远设计
分类：社科文学类资料
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属性：4 页
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时间：2024-04-23
