代谢调控下放线菌抗生素生物合成的不同方法

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微生物能够产生多种具有生物活性的次级代谢产物，其中大部分活性次级代谢产物来源于放线

菌[1],这些物质具有抗菌、抗肿瘤、杀虫、免疫抑制和免疫激活等功效，被广泛地应用于医药

业、农业、兽业、食品工业等领域。近年来，随着抗生素耐药菌的不断出现，深入研究放线菌

的次级代谢调控过程，提高放线菌抗生素的生物合成，发现和生产新抗生素变得越来越迫切。

代谢调控是通过重组 DNA 技术或其他技术，有目的地改变生物体中已有的代谢网络和表达调

控网络，改善细胞的性能，并用于化学转化、能量转移及大分子装配的过程。本文总结了通过

代谢调控来提高放线菌抗生素生物合成的不同方法（图 1 ）,主要包括调节调控基因表达，增

加基因簇拷贝数及基因簇的异源表达，过表达抗性基因和转运基因，提高前体代谢通量和核糖

体工程。

1 调节调控基因的表达

抗生素的生物合成基因一般成簇存在，除了含有结构基因之外，通常还包含调控基因以及抗生

素的抗性基因和转运基因。抗性基因、调控基因和转运基因组成了一种协同机制，共同调控抗

生素的生物合成。

调控因子是一类在基因表达调控中，能直接或间接地识别或结合在各顺式作用元件序列上，参

与调控靶基因转录效率的蛋白质。抗生素生物合成基因簇的转录起始普遍依赖全局或途径特异

调控蛋白的调控。全局调控因子不仅调控多种抗生素的产生，还参与放线菌的形态学分化，其

调控的方式较为复杂和广泛。而途径特异性调控因子主要参与特定的抗生素的生物合成过程，

与全局调控因子相比，其调节的方式更为直接。有些调控因子既可以作为全局调控因子，也可

以对抗生素的生物合成进行途径特异性调控。例如 TetR 家族转录调节因子（ TetR family

transcriptional regulator,TFR ）.

TFRs 是一类常见的原核转录调控蛋白家族，参与调控多种代谢和生理过程，如抗生素的生物

合成、三羧酸循环和生物膜的形成。TFRs 通常以同源二聚体的形式存在，每一个单体包括一

个相对保守的 N 端DNA 结合（ DNB ）区域，一个 C 端配体结合和聚合作用（ LBD ）区域。

通常 DNB 区域具有保守的螺旋-转角- 螺旋的特征性结构，而 LBD 区域则根据结合配体的不同

而表现出序列和结构的多样性。

TFRs 的C 端区域介导自身形成同源二聚体，二聚体化的 TFRs 的N 端DNB 结构域与被调控基

因的上游启动子区域结合，使 RNA 聚合酶-启动子转录复合物不能转变成有效的转录状态，从

而阻止下游受调控基因的转录起始[3]. 但是当TFRs 与小分子配体结合后，会使构象发生改变并

从DNA 上解离，从而启动下游基因的转录[4].

1. 1 途径特异性调控因子

途径特异性调控基因一般存在于次级代谢产物的生物合成基因簇内，主要包括链霉菌抗生素调

控蛋白（ SARP ）家族。途径特异性调控因子的作用分为正向调节和负向调节，通过途径特异

性正调控基因的过表达，负调控基因的敲除可以提高抗生素的生物合成。近年来，途径特异性

调控因子应用于提高放线菌抗生素的生物合成取得了较多的进展（表 1 ）.

Zhu 等[5] 从深海放线菌（ Marinactinospora ther-motolerans SCSIO 00652 ）中发现了一种核苷类

抗生素 A201A, 利用全基因组扫描（whole-genome scan-ning ）技术，对基因组片段化后建立的

基因组文库进行测序，识别并确证了其生物合成基因簇，并通过序列比对分别推测了基因簇中

不同基因的功能，查找并验证了一个负向调控基因 mtdA.HPLC 分析基因敲除菌株的发酵提取

物，发现抗生素 A201A 的产量提高了近 25 倍。

Zhang 等[6] 发现 PapR6 是普那霉素（ pristina-mycin II ）生物合成的一种途径特异性激动

剂，papR6 基因敲除菌株普那霉素的产量明显降低，过表达 papR6 基因后的菌株普那霉素的合

成明显增加。凝胶阻滞实验（electrophoretic mobility shiftassay,EMSAs ）分析表明： PapR6 蛋

白与 snaF 基因的上游区域发生特异性结合。snaF 基因是 snaFE1E2GHIJK 操纵子的第1 个基

因，负责前体异丁酰基辅酶 A 和中间体 C11 α，β-不饱和硫酯的生成。转录分析结果表

明，papR6 基因敲除后的菌株snaFE1E2GHIJK 操纵子的表达量明显减少。这些结果证明了

PapR6 调控因子通过直接调控结构基因 snaF 的表达上升，增加前体和中间体的产生，从而提

高普那霉素的生物合成。

1. 2 全局调控因子

除了途径特异性调控因子以外，全局调控因子则是位于抗生素生物合成基因簇之外，可以调控

多种次级代谢途径，并不局限于一种抗生素的生物合成途径，因此其调控的范围更加广泛、模

式更加复杂。近年来，全局调控因子应用于提高抗生素生物合成并取得了较多进展（表 2 ）.

Crp 是天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor 的一种全局调控因子，与菌体的形态学分化有关。

Gao 等[15] 首次证明了Crp 参与了调控链霉菌的次级代谢和抗生素的生物合成。利用染色质免

疫共沉淀- 芯片（ChIP-chip ）技术分析Crp 蛋白的基因结合位点，在 22 个与次级代谢相关的

基因簇中，有 8 个是与 Crp 蛋白结合的位点。对这些次级代谢基因进行转录分析，发现基因的

转录水平明显受到了影响，其中有 6 个基因簇与 ChIP-chip 技术分析的Crp 蛋白的结合位点相

同。crp 基因敲除后的菌株抗生素 Act、Red 和CDA 的生物合成明显下降。这些数据都表明

Crp 蛋白可以通过与抗生素的生物合成基因簇相互作用，从而影响多种次级代谢过程，在天蓝

色链霉菌中作为一种全局正向调控因子，调控多种抗生素的生物合成。

WblA （sco ）是天蓝色链霉菌中的一种全局负调控因子，负调控抗生素 Act、Red 和CDA 的

产生[20-21].Rabyk 等[22] 在链霉菌Streptomyces gha-naensis 中发现了 wblA （gh ）基因，敲除

该基因后，默诺霉素（ moenomycin ）的产量增加了 2. 3 倍。

Noh 等[23] 构建了一个阿霉素（ doxorubicin,DXR ）和道诺霉素（ daunorubicin,DNR ）高产菌株

的全基因库，以 wblA （sco ）作为探针，利用种间 DNA 微矩阵分析（interspecies DNA

microarray analysis ）, 发现链霉菌Streptomyces peucetius 中存在 wblA （spe ）与 wblA （sco ）

具有 95% 的氨基酸序列相似度。基因 wblA （spe ）敲除后的菌株，DXR 和DNR 的产量有将

近70% 的增长。这些结果表明： wblA （spe ）和 wblA （gh ）、wblA （sco ）一样，是一种

全局负调控基因，调控多种抗生素的生物合成。wblA 基因广泛存在于各种链霉菌中，负调控

各类抗生素的生物合成。

2 调控抗生素生物合成基因簇的表达

2. 1 增加抗生素生物合成基因簇的拷贝数

在抗生素的生物合成基因簇已知的条件下，增加基因簇的拷贝数可以达到直接增加抗生素生物

合成的目的，但是由于同样受到其他调控因素的影响，抗生素的产量提高有限。井冈霉素A（

validamycin A,VAL-A ）是一种抗真菌类抗生素，用于治疗水稻和其他植物的纹枯病。Zhou 等

[27] 通过在链霉菌Streptomyces hygro-scopicus 5008 中集成zouA- 介导的 DNA 扩增系统，在

VAL-A 基因簇内部扩增了约3 ~5 个VAL-A 的生物合成基因簇，工程菌摇瓶培养后，VAL-A

的产量比野生菌株提高了 34%.

Liao 等[28] 在尼克霉素的产生菌 Streptomycesansochromogenes 7100 的染色体中插入了 35 kb 的

尼克霉素生物合成基因簇，工程菌的尼克霉素产量明显提高。其中尼克霉素X 产量达到880

mg/L, 是野生菌株的4 倍；尼克霉素Z 的产量达到180 mg / L, 是野生菌株的1. 8 倍。

达托霉素（ daptomycin ）是链霉菌Stretptomycesroseosporus 产生的一种天然的环脂肽类抗生

素，具有广谱的革兰阳性菌杀菌活性。Liao 等[29] 在链霉菌Stretptomyces roseosporus 中敲除达

托霉素的结构基因 dptJ, 工程菌的达托霉素的产量降低了50%, 而dptJ 基因加倍的菌株，达托霉

素的产量提高了 110%.

2. 2 调控抗生素生物合成基因簇的异源表达由于从自然界中分离的野生菌株对其性质研究有

限，代谢网络复杂，中间产物复杂、不稳定或者终产物表达量低，限制了其体内抗生素生物合

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摘要：

代谢调控下放线菌抗生素生物合成的不同方法微生物能够产生多种具有生物活性的次级代谢产物，其中大部分活性次级代谢产物来源于放线菌[1],这些物质具有抗菌、抗肿瘤、杀虫、免疫抑制和免疫激活等功效，被广泛地应用于医药业、农业、兽业、食品工业等领域。近年来，随着抗生素耐药菌的不断出现，深入研究放线菌的次级代谢调控过程，提高放线菌抗生素的生物合成，发现和生产新抗生素变得越来越迫切。代谢调控是通过重组DNA技术或其他技术，有目的地改变生物体中已有的代谢网络和表达调控网络，改善细胞的性能，并用于化学转化、能量转移及大分子装配的过程。本文总结了通过代谢调控来提高放线菌抗生素生物合成的不同方法（图1）,主要包括调...

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