产油微生物研究中组学技术的具体运用

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产油微生物研究中组学技术的具体运用

　　摘　　　　要：微生物油脂是未来燃料和食品用油的重要潜在资源。近年来，随着系统生物学

技术的快速发展，从全局角度理解产油微生物生理代谢及脂质积累的特征成为研究热点。组学

技术作为系统生物学研究的重要工具被广泛用于揭示产油微生物脂质高效生产的机制研究中，

这为产油微生物理性遗传改造和发酵过程控制提供了基础。文中对组学技术在产油微生物中的

应用概况进行了综述，介绍了产油微生物组学分析常用的样品前处理及数据分析方法，综述了

包括基因组、转录组、蛋白(修饰)组及代谢(脂质)组等在内的多种组学技术，以及组学数据基

础上的数学模型在揭示产油微生物脂质高效生产机制中的研究，并对未来发展和应用进行了展

望。

　　　关键词：基因组; 转录组; 蛋白组; 代谢组; 产油微生物;

　　 Abstract： Microbial oils are potential resources of fuels and food oils in the future. In recent

years, with the rapid development of systems biology technology, understanding the physiological

metabolism and lipid accumulation characteristics of oleaginous microorganisms from a global

perspective has become a research focus. As an important tool for systems biology research, omics

technology has been widely used to reveal the mechanism of high-efficiency production of oils by

oleaginous microorganisms. This provides a basis for rational genetic modification and fermentation

process control of oleaginous microorganisms. In this article, we summarize the application of omics

technology in oleaginous microorganisms, introduced the commonly used sample pre-processing and

data analysis methods for omics analysis of oleaginous microorganisms, reviewe the researches for

revealing the mechanism of efficient lipid production by oleaginous microorganisms based on omics

technologies including genomics, transcriptomics, proteomics(modification) and

metabolomics(lipidomics), as well as mathematical models based on omics data. The future

development and application of omics technology for microbial oil production are also proposed.

　　 Keyword： genome; transcriptome; proteome; metabolome; oleaginous microorganisms;

油脂在食品生产、营养补充剂、清洁剂、润滑剂和生物燃料等方面均有较高的需求。随着人口

的增加和耕地面积的减少，微生物油脂(Microbial oils)成为了近年来的研究热点，且被认为是

未来食品和燃料用油重要的潜在资源[1,2]。微生物油脂，又称单细胞油脂(Single cell

oils,SCO)，是指由微生物发酵生产的脂质。微生物油脂具有生产周期短、不受季节气候影响、

不占用耕地且易于大规模生产的特点，符合绿色可持续发展的理念[3]。通常情况下，微生物胞

内积累的脂质含量达到菌体干重 20%以上即可被认为具有工业化生产油脂的潜力，称之为产油

微生物[4,5]。产油微生物主要包括细菌、酵母、丝状真菌及藻类等,不同产油微生物的油脂产量

相差巨大，其油脂积累量从细胞干重的 20%到80%以上不等，且产油微生物有不同的产脂特点

[1,6,7]。产油真菌(酵母和丝状真菌)胞内脂质积累量在 30%–70%之间，产油酵母合成的脂肪酸

以十六碳和十八碳的饱和、不饱和脂肪酸为主，而产油丝状真菌在胞内积累大量脂质以十八碳

以上的多不饱和脂肪酸为主，如亚油酸、γ-亚麻酸、花生四烯酸及二十碳五烯酸等。产油藻类

胞内脂质积累量通常在 20%–70%之间，藻类能够合成高附加值的长链多不饱和脂肪酸，尤其

是二十二碳六烯酸。产油细菌胞内脂质积累量最高可达 80%以上，合成的脂质以类脂为主，主

要成分为聚羟基烷酸。

　 1　、产油微生物研究进展

关于微生物油脂的研究已有较长的历史。20 世纪 80 年代之前(1980s)，揭示产油微生物油脂积

累的生化基础是相关领域科研工作者关注的焦点[8]。在随后的 20–30 年里，随着 omega-

3、omega-6 脂肪酸在包括人类在内的高等生物中的结构和功能作用被逐渐认识，利用微生物工

业化生产高附加值油脂开始引起研究人员的兴趣。产油微生物脂质积累过程中涉及的脂质合成

途径及关键酶的酶学性质在生化层面得到了更为全面的阐明和验证[9]。在此基础上提出了多种

针对培养基组成、发酵过程控制和代谢工程改造的策略，微生物油脂逐渐进入工业化时代

[10,11,12,13,14]。同时，在油脂高产菌株的诱变、育种工作方面[15]，相关的胞内油脂实时监

测等高通量筛选方法被迅速开发[16,17,18]。随着近些年分子生物学、基因编辑以及高通量测序

技术的快速发展，大量研究借助组学技术从系统生物学层面完成了产油模式菌株脂质合成全途

径构建[19,20,21]。本文从代谢、调控、信号传导等多个层次系统地对产油微生物脂质积累的代

谢及调控机制进行了解析和阐述，并以此为基础指导发酵过程控制、代谢工程改造和脂质合成

细胞工厂的构建[22,23]。

2 　、组学技术在产油微生物中的应用

组学(Omics)主要包括基因组学、转录组学、蛋白(修饰)组学、代谢(脂质)组学以及在其基础上

构建的代谢网络模型，是以高通量检测与生物信息学技术为基础的系统生物学分析方法，能够

从基因组规模反映生物体的全局转录、翻译及代谢情况。自组学概念提出以来，在技术方面一

直处于较快的发展和持续的更新中，目前已在医药、农林、食品等多个领域的基础、临床、生

产研究中广泛应用[24,25,26,27]。近些年，随着系统生物学与合成生物学的快速发展，基于组

学分析的系统发酵优化以及遗传改造策略被提出，且已在工业微生物领域得到了广泛研究和成

功应用[28,29,30,31]。

近几年，组学技术在产油微生物中得到广泛应用，相关研究内容主要集中在以下几方面。首先

是组学分析方法的评估和优化，涉及样品收集、前处理、提取、检测及数据分析等流程

[32,33,34,35,36]。第二方面是基于组学分析结果指导发酵工艺优化及过程控制。通过组学分析

明确微生物在发酵过程中对环境及营养的响应，并针对性地对微生物发酵不同阶段的环境参数

和包括基本营养物、中间代谢物在内的多种成分进行更为合理的阶段控制和补加[37]。第三方

面主要是采用单一组学或多组学整合技术从不同维度解析影响产油微生物生长、代谢及脂质合

成的代谢及调控机制[38,39,40,41]。通过组学分析确定菌株发酵过程中与菌株生长及目标产物

合成相关的关键基因、蛋白和代谢途径，并提出合理的代谢工程策略[19,42]。

2.1 　、产油微生物组学技术分析方法学概况

组学分析主要可分为样品制备和检测分析两大部分[35,43,44]。样品制备主要包括样品收集、淬

灭、提取等步骤[35,44,45]。由于不同样品(细胞、组织、粪便、土壤等)在来源和形态上存在较

大差异，优化和评估样品前处理方法是保证后续检测结果稳定准确的前提条件。产油微生物样

品制备方法主要参考微生物种类，微生物包括单细胞形式存在的大多数细菌、酵母及藻类等，

也包括多细胞形式存在的丝状真菌，由于不同产油微生物菌体形态不同，在样品前处理上也有

着明显差异。在样品收集方法上，细菌、酵母和藻类通常采用离心法分离细胞和发酵液

[46,47]，而丝状真菌通常采用快速抽滤法(表1–4)[48]。在淬灭方法上，液氮快速冷冻在不同产

油微生物中均最为常用[49]，也有部分研究在样品收集后进行超低温保藏(表1–4)[47,50]。对于

目标物(DNA、RNA、蛋白或代谢物)提取，用于基因组和转录组分析所需的核酸提取方法在不

同产油微生物间差异不大，目前主要采用Trizol 试剂或商业化的提取试剂盒[47,51]。而对用于

蛋白组、代谢组(脂质组)分析所需的胞内蛋白和代谢物的提取在提取试剂和步骤上差异较大(表

1–4)。产油微生物胞内总蛋白提取目前常用方法包括两种，一种是在植物中广泛应用的 Tris-饱

和酚提取法，另一种是比较通用的尿素裂解液提取法，部分实验组还考虑加入了一定量的十二

烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)或二硫苏糖醇(Dithiothreitol,DTT)[52,53]。代谢物提取

目前常用的提取溶剂包括甲醇-水、乙腈-水、乙醇-水(热提取)等[54]。甲醇-氯仿是目前产油微

生物胞内脂质提取最为常用的提取剂[55]。近些年，考虑到提取试剂的安全性和提取操作方便

性，甲基叔丁基醚也在细胞脂质提取中得到广泛应用[56,57]。通常情况下，产油微生物胞内物

质提取过程中会采用液氮研磨或超声等手段对菌体进行破碎以提高目标物的浸出效率[58,59]。

由于产油微生物胞内脂质积累量较多，在进行目标物提取时，选取丙酮、氯仿等在提取前或提

取过程中对样品进行除脂处理可获得质量更高的目标物，以减少脂质对后期检测的干扰[60]。

对于目标物的检测，基因组和转录组测序目前均采用Illumina 测序平台[61,62,63,64,65,66](表1–

2)。代谢组检测主要采用的是液相色谱质谱联用(LC-MS/MS)和气相色谱质谱联用(GC-MS)

[67]，还有部分代谢组分析采用核磁(NMR)技术[68]，而脂质组分析均采用LC-MS/MS 平台

[69,70](表4)。

组学分析另外一个重要的影响因素是参考数据库的选择。产油微生物基因组注释目前主要是参

考已有的同源物种基因组信息，如借助 NCBI、Uni Port、KEGG、GO 等数据库进行基因功能

和代谢途径等注释。尽管目前转录组和蛋白组分析仍以无参分析最为常见，但随着测序技术快

速的发展和费用降低，完成全基因组测序的产油菌株数量快速上升。因此，利用自身基因组构

建本地库进行转录组和蛋白组结果注释(有参分析)也逐渐增多。对于代谢组代谢物注释，目前

主要是借助一些商业化(如NIST、mz Cloud 等)和开源的数据库(如HMDB、Mo NA 等)来完成

代谢物的鉴定工作，也有部分研究机构和商业化公司会自行构建代谢组数据库。

　 2.2 　、组学技术在产油微生物脂质积累机制研究中的应用

　　 2.2.1 　、基因组分析

在基因组层面的应用主要通过比较基因组学分析，包括产油微生物彼此间比较(如高低产菌

株)、产油和非产油菌株间比较，以及基于基因组的代谢网络模型(Genome-scale metabolic

model,GSMM)构建(表1)。随着测序技术的进步和费用的下降，完成全基因组测序的微生物菌

株数量逐年上升，这为产油微生物比较基因组研究提供了基础[71]。笔者课题组前期完成了高

山被孢霉 Mortierella alpina ATCC 32222 的全基因组测序，构建了高山被孢霉脂质合成全途径

[72]，并在此基础上构建了高山被孢霉基因组规模的代谢网络模型，系统阐述了高山被孢霉脂

肪酸合成所需还原力NADPH 和前体乙酰辅酶 A的主要来源途径[73]。Sheng 等[74]将产油酵母

发酵丝孢酵母 Trichosporon fermentans CICC 136 基因组与其他产油微生物进行基因组比较发

现，T.fermentans CICC 136 具有高度的基因重复性和独特的基因组组成，与圆红冬孢酵母

Rhodosporidium toruloides NP11 和解脂耶氏酵母 Yarrowia lipolytica CLIB122 相比，其脂肪酸延

伸和降解相关的基因数量高出3–4 倍，这些结果提示 T.fermentans CICC 136 具有较强的脂肪酸

合成和代谢能力。Vorapreeda 等[75]将产油微生物和非产油微生物基因组进行对比发现，有 209

个直系同源蛋白序列存在于产油微生物中，分布于细胞的多个生物学过程，代谢分类发现这些

基因主要参与脂肪酸和脂质前体，尤其是乙酰辅酶 A的合成。该作者在产油微生物中还发现了

一系列负责通过柠檬酸分解代谢、脂肪酸 β氧化、亮氨酸代谢和赖氨酸降解来产生脂肪酸合成

所需的关键双碳代谢物的同源蛋白，并指出在生物合成双碳代谢物乙酰辅酶 A的过程中，碳水

化合物、脂质和氨基酸代谢之间存在密切关系，有助于其脂质生成。Vongsangnak 等[76]通过

对3株产油模式微生物基因组规模代谢模型比较分析发现，卷枝毛霉 Mucorcircinelloides

WV1213 相比M.alpina CY1106 和Y.lipolytica YL619＿PCP 具有更多参与碳水化合物、氨基酸

和脂质代谢的基因，这有利于M.circinelloides WV1213 营养利用的多样化，提高其脂质含量。

可以看出，目前产油微生物基因组比较主要是考察不同菌株间参与脂质合成途径基因数量、脂

肪酸合成前体乙酰辅酶 A合成能力以及对营养的利用差异。

2.2.2　、转录组分析

在转录层面的应用主要包括转录组分析、转录因子挖掘、转录调控网络的构建。转录组是目前

在产油微生物中应用最为广泛的组学技术(表2)。产油微生物自身具有较强的脂质积累能力，

而特定营养或环境胁迫会诱导产油微生物胞内脂质积累量大幅提高。当外部营养或环境发生改

变时，产油微生物最先做出的响应往往发生在调控层面，激发自身的抗逆信号响应途径，进而

引发全局性代谢重编程。笔者课题组前期完成了对产油丝状真菌高山被孢霉 ATCC 32222 氮限

制培养过程的时间序列转录组分析，将高山被孢霉与其他产油微生物和非产油微生物全细胞转

录本进行了比较，确定了磷酸戊糖途径在产油微生物脂质合成所需还原力NADPH 供应上的重

要作用[77]。Morin 等[78]对产油微生物 Y.lipolytica 从生物量合成转向脂质积累这一过程进行时

间序列转录组分析，通过差异表达基因鉴定以及时间序列趋势聚类分析，作者详细描述了解脂

耶氏酵母从生长转向脂质积累过程中不同阶段细胞基因表达特征，探究了解脂耶氏酵母作为产

油微生物的潜力，鉴定出了参与脂质积累过程中的关键基因。Wang 等[79]以玉米浆作为氮源，

通过比较培养基中不同玉米浆添加量对产油微生物破囊壶菌Aurantiochytrium sp.YLH70 转录组

的影响发现，高中低含量玉米浆培养的 Aurantiochytrium sp.YLH70 转录本间有着显着性差异，

玉米浆含量(氮含量)对细胞产脂的影响是一个全局性的调控，特定信号传导及其相关转录因子

在这一全局调控中发挥了重要作用。Ajjawi 等[80]在微拟球藻Nannochloropsis gaditana 中通过

敲除真菌同源的 Zn(Ⅱ)2Cys6 编码基因使得菌株脂质产量相比野生型菌株提高了 2倍。Hu 等

[81]对Nannochloropsis sp.进行了基因组规模转录因子及其结合位点的鉴定，通过比较6株微拟

球藻基因组相关的 68 个转录因子结合位点motifs,11 个转录因子被预测为与脂质代谢和光合作

用相关，将微拟球藻Nannochloropsis oceanica IMET1 的转录因子，转录因子结合位点motifs 与

植物参考数据库进行比对，共预测出 78 个转录因子-转录因子motifs 互作对，这些互作对包括

34 个转录因子(11 个参与甘油三酯合成)，30 个转录因子潜在位点motifs 以及 2 368 个转录因子

与目的基因间的调控连接点，这项研究为进一步在微拟球藻中构建用于微生物油脂生产的转录

调控网络奠定了基础，同时也为基于全局转录调控的脂质高效合成策略提供了参考。

　 2.2.3 　、蛋白组分析

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摘要：

产油微生物研究中组学技术的具体运用　　摘　　　　要：微生物油脂是未来燃料和食品用油的重要潜在资源。近年来，随着系统生物学技术的快速发展，从全局角度理解产油微生物生理代谢及脂质积累的特征成为研究热点。组学技术作为系统生物学研究的重要工具被广泛用于揭示产油微生物脂质高效生产的机制研究中，这为产油微生物理性遗传改造和发酵过程控制提供了基础。文中对组学技术在产油微生物中的应用概况进行了综述，介绍了产油微生物组学分析常用的样品前处理及数据分析方法，综述了包括基因组、转录组、蛋白(修饰)组及代谢(脂质)组等在内的多种组学技术，以及组学数据基础上的数学模型在揭示产油微生物脂质高效生产机制中的研究，并对未来发...

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