HSA与脂肪酸的关系研究中T2W-RD-Water LOGSY技术的运用
HSA 与脂肪酸的关系研究中 T2W-RD-Water
LOGSY 技术的运用
摘要： 脂肪酸在哺乳动物的能量代谢中发挥着至关重要的作用, 同时也是合成细胞膜磷脂和
其他生物活性化合物的重要物质.脂肪酸在血液中的溶解度很低, 主要以与蛋白质结合状态存在,
白蛋白是游离脂肪酸的主要运输者和储存者.因此, 研究脂肪酸和白蛋白的相互作用具有非常重
要的医学和生物学意义. 本文主要利用基于核磁共振 (NMR) 的组氨酸选择性检测技术 T2W-RD-
Water LOGSY 研究天然同位素丰度人血清白蛋白 (HSA) 与脂肪酸的相互作用, 结果发现脂肪酸
结合前后, HSA 的特征组氨酸谱图变化明显, 部分组氨酸信号的相对强度随脂肪酸浓度的增加而
不断减小, 相应的滴定曲线分析表明 HSA 表面有两个强的脂肪酸结合位点.此外, 部分谱线的化
学位移变化说明 HSA 和脂肪酸的强结合还会引发 HSA 相应的构象变化.
Abstract： Fatty acids are important substrates for the synthesis of membrane phospholipids and
other bioactive compounds, and thus play vital roles in mammalian energy metabolism. Fatty acids
often bind to proteins in the blood. Albumin is a major carrier and depot of free fatty acids. In this
paper, the interactions between human serum albumin (HSA) and fatty acids were studied using
nuclear magnetic resonance (NMR) -based histidine selective detection technology T2W-RD-Water
LOGSY. The spectra of HSA before and after fatty acids binding were compared. It was found that
signals of the characterized His in HSA changed significantly with the addition of fatty acids. Two
high-affinity binding sites between the HSA and fatty acids were identified from the titration curve. It
was also demonstrated that binding to fatty acids could induce conformation changes for HSA.
Keyword： nuclear magnetic resonance (NMR) ; T2W-RD-Water LOGSY; human serum albumin
(HSA) ; fatty acid; histidine;
0、引言
脊椎动物体内含有非常丰富的白蛋白, 而人血清白蛋白 (Human Serum Albumin, HSA) 在人体血
清中含量高达血清蛋白总量的 60%~65%, 其主要作用是调节渗透压.功能上, 白蛋白作为转运蛋
白可以广泛运载和短暂存储各种内源性与外源性的化合物, 例如转运脂肪酸、影响多种药物的
代谢动力学、清理有毒代谢物、提高血清抗氧化能力等[1].早在 1941 年, Kendall 等人[2]就首次
发现 HSA 结合脂肪酸 (Fatty Acid, FA) 的现象, “当时提出 血清中某些染料使白蛋白重结晶 4次
之后仍然呈现黄色, ”怀疑这些染料本质上可能是类脂 .随后的几十年中, 随着科学技术的进步, 不
断有研究进一步揭示白蛋白结合脂肪酸的能力.晶体结构显示[3], 白蛋白表面以非对称的形式分
布着 7个当量的中长链脂肪酸结合位点, 并有着不同的结合强度, 表明白蛋白与脂肪酸的作用形
式复杂多样.在正常的人生理条件下, 每摩尔 HSA 大约可以结合 0.1~2.0 mol 脂肪酸[4].目前, 人
们对脂肪酸的摄取主要是饱和脂肪酸, 越来越多的研究表明, 脂肪酸与许多疾病, 包括癌症的产
生都有着密切关系, 且游离脂肪酸对机体脂代谢的反应比甘油三酯和胆固醇更为灵敏, 一些重要
游离脂肪酸含量的异常变化是病情发展的重要依据.然而由于游离脂肪酸的水溶性极差, 通常需
要结合血清白蛋白进行储存和运输, 因此对人体血液中白蛋白与脂肪酸的相互作用研究具有非
常重要的意义.
研究表明, 在蛋白质与配体的相互作用中, 组氨酸 (Histidine, His) 是常见的活性中心, 具有重要的
功能, 并发挥着不可替代的作用.这主要得益于其独特的分子结构, 组氨酸有一个咪唑侧链, 咪唑
环侧链的 p Ka 约为 6.0, 使得组氨酸的 p Ka 相对中性, 这就意味着在细胞中很小的 p H 变化都会
引起组氨酸的电荷变化[5].正因为如此, 组氨酸在各种蛋白中常作为配体结合位点, 同时也作为
酶催化的活性中心, 例如促胰凝素的催化功能[6].从本质上讲, 咪唑侧链上有两个性质不同的氮
原子, 其中一个结合氢原子呈弱酸性, 另一个含孤电子对呈碱性, 因此组氨酸既可以作为酸提供
质子, 又可以作为碱接受质子, 还可以同时作为氢键供体和氢键受体.在生理条件下, 组氨酸同时
以3种不同的状态存在:一种质子化状态, 两种不同的中性互变异构体状态, 多样化的存在形式使
组氨酸可以作为亲核试剂、酸碱催化剂、质子梭子等, 因此可作为研究蛋白质动态结构和蛋白
配体相互作用的一个理想探针.
在构成白蛋白的 585 个氨基酸中, 共有 16 个组氨酸, 其中 5个位于结构域表面, 分别为domain I
的His67、His146 和domain II 的His242、His247、His288[7].这些组氨酸不仅涉及白蛋白的构象
变化, 而且参与锌离子、脂肪酸等配体的相互作用[7-9] (如图 1所示) .不同物种血清白蛋白的序
列比对显示组氨酸位点和数目都高度保守, 这更进一步说明了组氨酸在白蛋白生物活性中扮演
重要的角色.因此, 研究蛋白质表面组氨酸与配体的相互作用对于我们了解白蛋白结合脂肪酸的
作用机制至关重要.
近些年来, 除了晶体衍射, 液体核磁共振 (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) 技术在白蛋白多结
合位点研究中应用广泛[10,11].有人通过使用 13C 标记的长链脂肪酸, 采用1D 13C NMR[12]和
2D1H-13C HSQC[13]等方法观测小分子以表征不同脂肪酸与白蛋白的结合位点及结合强度.然
而, 对于白蛋白这样分子量较大的天然同位素丰度蛋白质, 常规手段依然很难直接对其进行观察.
一些用于研究配体与蛋白之间的相互作用的技术, 如Water LOGSY[14] (Water-Ligand Observed
via Gradient Spectroscop Y) , STD (Saturation Transfer Difference) 技术等, 直接观测参与相互作用
的小分子, 能够很容易区分出小分子是否能够结合靶标大分子, 因此在高通量药物筛选方向应用
非常广泛[15], 但是此类方法难以获得关于大分子的作用信息, 如结合位点等.
本课题组前期研究中, 在Water LOGSY 的基础上, 使用水的辐射阻尼 (Radiation Damping, RD)
效应取代选择性脉冲或组合脉冲来完成对水磁化矢量的选择性激发, 降低由此产生的弛豫效
应、扩散效应和饱和效应, 以提高 Water LOGSY 实验的灵敏度[16].对于单一大分子体系, 同时
结合横向弛豫加权(T2 Weighted, T2W) 技术, 通过调节自旋回波的时间来滤掉蛋白主链宽包信
号, 从而保留蛋白分子表面与溶剂分子有快交换或强核 Overhauser 效应(Nuclear Overhauser
Effect, NOE) 的信号, 进而获得蛋白质表面组氨酸的信号, 并通过观测其化学位移等随配体浓度
的变化, 获得相互作用信息.这些工作表明 T2W-RD-Water LOGSY 技术能够大大简化HSA 1D
1H NMR 谱, 且低场区域信号大部分来自于白蛋白结构域表面的组氨酸[17].本文在上述工作基
础上, 对检测到的HSA 表面组氨酸信号进行了部分归属, 并将T2W-RD-Water LOGSY 技术应用
于HSA 与脂肪酸的相互作用研究.
1 、 实验部分
1.1 、实验试剂
HSA 固体粉末 (去脂肪酸, 纯度>98%) 、无水磷酸氢二钠 (Na2HPO4) 、二水合磷酸二氢钠 (Na
H2PO4×2H2O) 、二硫苏糖醇 (Dithiothreitol, DTT) 、十六碳饱和脂肪酸 (C16:0) 、二甲亚砜
(Dimethylsulphoxide, DMSO) 和重水(D2O) 均购于Sigma-Aldrich 公司.
1.2 、 样品配制
脂肪酸储液制备:使用分析天平准确称量 25.6 mg 脂肪酸 (C16:0) 粉末溶于 500μL DMSO 中, 得到
200 mmol/L 的脂肪酸储液, 放入 4℃冰箱存储备用.
HSA-FA 复合物制备:配制终浓度为 0.5 mmol/L 的HSA 于100 mmol/L 且p H 为7.40 的PBS 缓冲
溶液中, 并与脂肪酸储液一同放入 37℃恒温水浴锅中温浴 5 min, 随后在 500mL HSA 样品中分别
滴加不同量脂肪酸储液使其最终与HSA 的比例(FA:HSA) 为
摘要：
展开>>
收起<<
HSA与脂肪酸的关系研究中T2W-RD-WaterLOGSY技术的运用摘 要： 脂肪酸在哺乳动物的能量代谢中发挥着至关重要的作用, 同时也是合成细胞膜磷脂和其他生物活性化合物的重要物质.脂肪酸在血液中的溶解度很低, 主要以与蛋白质结合状态存在, 白蛋白是游离脂肪酸的主要运输者和储存者.因此, 研究脂肪酸和白蛋白的相互作用具有非常重要的医学和生物学意义. 本文主要利用基于核磁共振(NMR) 的组氨酸选择性检测技术T2W-RD-Water LOGSY 研究天然同位素丰度人血清白蛋白(HSA) 与脂肪酸的相互作用, 结果发现脂肪酸结合前后, HSA的特征组氨酸谱图变化明显, 部分组氨酸信号的相对...
相关推荐
-
中华人民共和国气象法
2024-12-30 57 -
中国气象局关于修改《气象行政许可实施办法》的决定
2024-12-30 53 -
中国气象局关于修改《气象行政处罚办法》的决定
2024-12-30 96 -
中国气象局关于修改《防雷减灾管理办法》的决定
2024-12-30 163 -
中国气象局关于废止部分部门规章的决定
2024-12-30 45 -
通用航空飞行管制条例
2024-12-30 78 -
施放气球管理办法
2024-12-30 115 -
人工影响天气管理条例
2024-12-30 48 -
气象资料共享管理办法
2024-12-30 45 -
气象专用技术装备使用许可管理办法
2024-12-30 70
作者：闻远设计
分类：社科文学类资料
价格：免费
属性：6 页
大小：184.61KB
格式：DOCX
时间：2024-04-20
