国产胎盘间充质干细胞制剂溶血性探讨

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国产胎盘间充质干细胞制剂溶血性探讨

来源：学术堂作者：周老师

发布于：2015-08-06 共2568 字

间充质干细胞（ mesenchymal stem cells,MSCs ）来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能

干细胞，不仅有较强的增殖潜能，还能分化成不同来源的细胞，如神经细胞、脂肪细胞、成骨

细胞、软骨细胞、肝细胞及胰岛样细胞等，可作为理想的种子细胞，用于衰老和病变引起的组

织器官的损伤修复。临床上间充质干细胞在治疗多种血液系统疾病、肝硬化、神经系统疾病和

自身免疫性疾病等方面具有广泛的应用前景。国外已有多种间充质干细胞产品获批上市[1 ~2].

近几年来我国已经加大了对干细胞研究支持力度。本实验评价国产胎盘间充质干细胞制剂是否

可引起溶血和红细胞聚集，以便为其在临床上应用提供一定的科学依据。

材料与方法

1 材料

间充质干细胞人胎盘间充质干细胞，胎盘来源于自愿捐献者。经产妇及其家人签署知情同意

书。

动物日本大耳白兔，雄性，1 只，普通级，体重 2. 54 kg,购自北京隆安实验动物养殖中心。动

物使用许可证号： SYXK （津） 2011 -0005.

试剂胎盘间充质干细胞制剂顺昊细胞生物技术有限公司制备。RPMI - 1640 培养基、DMEM -

F -12 培养基，均为美国 Hyclone 公司生产； 10% 胎牛血清，兰州百灵生物科技有限公司生

产；淋巴细胞分离液，天津市灏洋生物制品科技有限公司生产。

仪器 Facsealibur 流式细胞仪，美国 BD 公司产品； 5424 离心机，德国 Eppendorf 公司产品；

Ckx22 显微镜，日本 Olympus 有限公司产品； Lxj - IIb 低速台式离心机，上海安亭科学仪器有

限公司产品； VarioskanFlash 酶标仪，美国 Thermo 公司产品。

2 间充质干细胞的分离提取和扩增

提取分离：无菌获取胎盘，立即浸入含 RPMI -1640 培养基、10% 胎牛血清及 1% 青- 链霉素

的组织保护液中，分离提取。剪取胎盘绒毛膜面1 ~2 cm 厚的组织，剪成 1 mm ×1 mm ×1 mm

的碎块，用 PBS 漂洗至无色，用胶原酶37 ℃ 水平摇床震荡 3 h,悬液用 100 μm 细胞筛过滤，上

清以 2000 r · min- 1 离心 10min,弃上清，所得沉淀即为间充质干细胞。

扩增：在沉淀细胞中，加入适量培养液混匀，转入T - 75 培养瓶中，以 37 ℃ 、5% CO2 培养

箱中培养。细胞生长至 80% 时，进行胰酶消化传代。传代时，以 0. 25% 胰蛋白酶 - EDTA 消

化3 ~ 4 min, 加血清终止消化；以 1500 r·min- 1 离心 5 min,弃消化液，加入细胞培养液，吹打

混匀，收集细胞悬液，接种于细胞培养瓶，置于37 ℃、5%CO2 培养箱中培养。

3 间充质干细胞样品的制备

将间充质干细胞重悬于含有 1% 人血白蛋白的复方电解质注射液中，制备浓度为 5. 0 ×

105cells·mL- 1. 将含有 1% 人血白蛋白的复方电解质溶液作为空白对照。阴性对照为0. 9% 氯化

钠注射液。阳性对照为去离子水。

4 溶血实验操作[3] 家兔麻醉后，经心脏取血 10 mL, 用玻璃珠除去纤维蛋白，用 0. 9%氯化钠注

射液反复清洗红细胞 3 次，至上清呈无色透明，弃上清，用 0. 9% 氯化钠注射液稀释成2%的红

血球混悬液。

取试管24 支，均分为 2 组并进行编号，其中每组1 ~ 5 管为间充质干细胞制剂管，第6 ~ 10 管

为空白对照管，第11 管为阴性对照管，第12 管阳性对照管。第2组试管为第1 组试管的复

管。参照表 1 进行加样。

用直接观察和酶标仪比色结合的方法，进行溶血实验。直接观察各管在15,30,45 min 和1,2,3 h

是否出现溶血和红细胞凝聚现象。酶标仪测定结果以光密度（ A ）表示，并计算各实验管溶血

率。如果受试药试管中溶液的溶血率小于5%,则表示无溶血。

结果

1 直接观察

1. 1 第1 组试管

阴性对照管（11 号） : 加样后15 ~45 min, 管中液体呈鲜红色浑浊；加样后1 h,少量上清液无

色澄明，下层液体呈鲜红色浑浊，少量红细胞沉于管底；加样后2 h,管底部逐渐出现深红色沉

淀，顶部上清液无色澄清且逐渐增多。孵育3 h,自培养箱取出试管，振摇后，见管底沉淀均匀

分散，无红细胞凝聚发生。以 2000 r·min- 1 离心后，见试管底部有少量沉淀，上清液呈无色澄

清。

直接观察所见，阴性对照管未发生溶血，见表 1.

阳性对照管（12 号） : 自加样 15 min 至3 h,管中液体呈澄明鲜红色，除管底部逐渐出现少量

沉淀外，无其他明显变化。孵育3 h,振摇，见管底沉淀均匀分散，无红细胞凝聚发生。离心

后，见试管底部有少量沉淀，上清液呈澄明鲜红色。直接观察所见，阳性对照管发生了溶血，

见表 1.

间充质干细胞制剂管（1 ~ 5 号）和空白对照管（6 ~10 号）的变化，与阴性对照组变化相

同，即直接观察所见，均未发生溶血，见表 1.

1. 2 第2 组试管（复管）

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国产胎盘间充质干细胞制剂溶血性探讨来源：学术堂作者：周老师发布于：2015-08-06共2568字间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSCs）来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，不仅有较强的增殖潜能，还能分化成不同来源的细胞，如神经细胞、脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肝细胞及胰岛样细胞等，可作为理想的种子细胞，用于衰老和病变引起的组织器官的损伤修复。临床上间充质干细胞在治疗多种血液系统疾病、肝硬化、神经系统疾病和自身免疫性疾病等方面具有广泛的应用前景。国外已有多种间充质干细胞产品获批上市[1~2].近几年来我国已经加大了对干细胞研究支持力度。本实验评价国产胎盘...

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