BHK-21细胞的代谢测定及其代谢动力学模型构建

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BHK-21 细胞的代谢测定及其代谢动力学模型

构建

来源：学术堂作者：周老师

发布于：2014-05-19 共4005 字

ＢＨＫ－２１细胞（Ｂａｂｙｈａｍｓｔｅｒｋｉｄｎｅｙｃｅｌｌ）是从叙利亚幼鼠

肾组织中分离培养获得的成纤维型贴壁细胞系，该细胞常用于多种病毒的增殖和纯化，如口

蹄疫病毒（Ｆｏｏｔ－ａｎｄ－ｍｏｕｔｈｄｉｓｅａｓｅｖｉ－ｒｕｓ，ＦＭＤ

Ｖ）、脑心肌炎病毒（Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒ－ｄｉｔｉｓｖｉｒｕｓ，ＥＭＣ

Ｖ）、呼肠孤病毒（Ｒｅｏｖｉｒｕｓ）和水疱性口炎病毒（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒｓｔｏｍ

ａｔｉｔｉｓｖｉｒｕｓ，ＶＳＶ）等，目前，该细胞广泛应用于口蹄疫疫苗的规模化生

产。在疫苗生产过程中需要对细胞的培养条件进行不断地优化来提高细胞密度和病毒产量，而

细胞代谢动力学特征研究是细胞培养条件优化最重要的内容之一。该文通过对静置培养条件下

ＢＨＫ－２１细胞生长的葡萄糖（Ｇｌｕｃ）、乳酸（Ｌａｃ）、谷氨酰胺（Ｇｌｎ）和氨

（ＮＨ４＋）的代谢进行测定和分析，建立了该细胞对Ｇｌｕｃ、Ｌａｃ、Ｇｌｎ和ＮＨ４＋

等物质的代谢动力学模型，为该细胞高密度培养条件优化提供参考。

１材料与方法

１．１材料

ＤＭＥＭ培养基（Ｇｉｂｃｏ），新生牛血清（兰州民海，使用时按培养液体积的１０％添

加）和胰蛋白酶（Ｇｉｂｃｏ，使用浓度为０．２５％）等。所用细胞为ＢＨＫ－２１细胞，

由甘肃省动物细胞工程技术研究中心提供。仪器设备为多参数生化分析仪（Ａｐ－ｐｌｉｔｅ

ｃｈ，ＮＯＶＡ４００）、细胞计数仪（ＩＮＮＯＶＡＴＩＳ，ＣＡＳＹＴＴ）、二氧化碳

培养箱（Ｔｈｅｒｍｏ，３１１１型）及倒置相差显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ，ＣＫＸ４１型）

等。

１．２方法

１．２．１细胞准备

常规法复苏ＢＨＫ－２１细胞，显微镜观察，待８０％以上细胞贴壁后，换液培养。细胞长

成致密单层后按１∶４传代培养，选用复苏后培养第３、４、５代的细胞分别进行生长动力和

代谢动力学试验。

１．２．２细胞生长动力学及活力曲线绘制

（１）低密度细胞悬液制备：取复苏后适应培养第３代的ＢＨＫ－２１细胞，用胰酶消化后制

成细胞悬液，计数，按有限稀释法的原则，将细胞悬液稀释至１．０×１０４～２．０

×１０４ｕｐｆ·ｍＬ－１。（２）接种及培养：将稀释好的细胞悬液接种到２４个Ｔ２５的细

℃ 胞瓶中，每瓶１０ｍＬ，置３７，５％ＣＯ２中培养。（３）计数、活力检查及样品收集：

从接种培养算起，每隔２４ｈ，取３瓶细胞将上清混合均匀，取３ｍＬ冷冻留样（用于细胞代

谢试验），然后分别消化计数，检查细胞活力，直至细胞密度降低为止。（４）平行试验：同

法对第４、５代的细胞进行试验，并计算各培养阶段的细胞密度和活力的平均值及其标准偏

差。（５）生长曲线绘制：以培养时间为横坐标，平均细胞密度和细胞活力为纵坐标，绘制细

胞的生长曲线和活力变化曲线。（６）计算细胞倍增时间：倍增时间＝Ｔ／Ａ（式中：Ａ＝ｌ

ｏｇ２Ｙ／Ｘ，其中，Ｙ为细胞峰值前１ｄ计得的数，Ｘ为接种细胞数，Ｔ为培养时间）。

１．２．３代谢动力学模型

（１）样品检测：将收集的各培养阶段的培养液样品用多参数生化分析仪检测Ｇｌｕｃ、Ｇｌ

ｎ、Ｌａｃ和ＮＨ４＋的浓度，并计算３个代次细胞各培养阶段的平均值及其标准偏

差。（２）代谢曲线绘制：以培养时间为横坐标，Ｇｌｕｃ、Ｇｌｎ、Ｌａｃ和ＮＨ４＋浓度

平均值为纵坐标绘图，即得代谢曲线图。（３）细胞指数：生长期比代谢速率计算求得

其中，Ｘ１和Ｘ２是２个取样点的细胞密度；ΔＳ是２个取样点被测物浓度的变化值；Δｔ是

子个取样点的时间间隔。

２结果与分析

２．１细胞生长曲线

ＢＨＫ－２１细胞在静置培养条件下生长曲线呈Ｓ型，前２４ｈ为适应期，２４～１２０ｈ为

对数生长期，以后便进入平台期和衰退期，平均最大增殖密度为５０．３×１０４ｕｐｆ·ｍＬ

－１，倍增时间为２１．１ｈ，绘制细胞生长曲线图如图１所示。细胞活力在所绘制的生长曲

线内保持较高水平，在培养后期开始下降。连续培养３个代次各阶段的平均细胞密度和活力见

表１。

２．２ＢＨＫ－２１细胞代谢动力学分析

ＢＨＫ－２１细胞在生长过程中要消耗Ｇｌｕｃ和Ｇｌｎ，同时代谢要产生废物Ｌａｃ和ＮＨ

４＋（见表２），在７２～９６ｈ内消耗Ｇｌｕｃ、Ｇｌｎ和生成Ｌａｃ、ＮＨ４＋的量最

高，在整个对数生长期内Ｇｌｕｃ和Ｇｌｎ的比消耗速率为－３．７９ｍｇ·（１０６ｃｅｌ

ｌｓ）－１·ｄ－１和－９．９５μｍｏｌ·（１０６ｃｅｌｌｓ）－１·ｄ－１，Ｌａｃ和ＮＨ

４＋的比生成速率为２．８１ｍｇ·（１０６ｃｅｌｌｓ）－１·ｄ－１和６．３０ μｍｏｌ

·（１０６ｃｅｌｌｓ）－１· ｄ－１（见表３）

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摘要：

BHK-21细胞的代谢测定及其代谢动力学模型构建来源：学术堂作者：周老师发布于：2014-05-19共4005字ＢＨＫ－２１细胞（Ｂａｂｙｈａｍｓｔｅｒｋｉｄｎｅｙｃｅｌｌ）是从叙利亚幼鼠肾组织中分离培养获得的成纤维型贴壁细胞系，该细胞常用于多种病毒的增殖和纯化，如口蹄疫病毒（Ｆｏｏｔ－ａｎｄ－ｍｏｕｔｈｄｉｓｅａｓｅｖｉ－ｒｕｓ，ＦＭＤＶ）、脑心肌炎病毒（Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒ－ｄｉｔｉｓｖｉｒｕｓ，ＥＭＣＶ）、呼肠孤病毒（Ｒｅｏｖｉｒｕｓ）和水疱性口炎病毒（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒｓｔｏｍａｔｉｔｉｓｖｉｒｕｓ，ＶＳＶ）等，目前，该细胞广泛应用于口蹄疫疫苗的规模化生产。在疫苗生产过程中需...

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