颗粒细胞在卵母细胞体外成熟过程中的作用

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颗粒细胞在卵母细胞体外成熟过程中的作用

来源：学术堂作者：姚老师

发布于：2015-08-29 共2811 字

卵母细胞体外成熟（IVM）是指将不成熟的卵母细胞，在体外模拟体内成熟的微环境，培养至

成熟卵子（MⅡ）的过程。此项技术开始于动物实验，早在 1935 年Pincus 发现兔子的不成熟卵

可以在体外成熟，并且这个成熟过程是自发的。

30 年后，Edwars 提出人类的不成熟卵母细胞可以体外发育成熟，并且通过实验证实其成熟过

程需要至少 24h.在卵母细胞的成熟过程中颗粒细胞通过缝隙连接传递多种信号，参与卵母细胞

减数分裂的启动以及卵胞浆的成熟。有研究表明，对颗粒细胞卵母细胞复合体（Cumulus-

oocyte comeplexes,COCs）行 IVM 时，体外成熟率与受精率显着提高[1].不过，也有试验证明，

颗粒细胞存在与否，并不能影响 IVM 的结局，甚至对卵母细胞的成熟与受精有负面影响[2].本

文以颗粒细胞与卵母细胞的联系及信号传递为切入点，探讨在不同培养条件下的 DOs 能否达

到和 COCs 相近的效果，更深层次研究颗粒细胞在 IVM 过程中的影响及作用，从而为 DOs 体

外成熟创造更适合的培养环境。

1资料与方法

1.1 实验动物

8~12 周龄体重>25g 健康 CD-1 小鼠（雌性 40 只，雄性 10 只）购自北京维通利华实验动物技术

有限公司，饲养在控温控湿及人工光照的条件下，自由饮水、采食。

1.2 IVM 培养基 IVM 基础培养

液购自瑞典 vitrolife 公司的卵裂期培养液（G1）；促卵泡生成素由瑞士 Serono 公司生产，剂量

为75IU/支；HCG 由瑞士 Serono 公司生产，剂量为 5 000IU/ 支。将上述试剂配置成含

FSH75IU/L 和HCG150IU/L 的IVM 培养液[3],并用配好的培养液制备四孔皿，每孔放 0.5~0.8ml

覆盖矿物油，放在 37℃、CO2 浓度为 6%培养箱中温浴不少于 6h 备用。

1.3 卵母细胞收集

雌鼠腹腔注射 HMG10IU,48h 后颈椎脱臼处死并取出卵巢。清除卵巢表面的结缔组织置于

MOPS 工作液中反复清洗。用 1ml 注射器穿刺卵巢表面，收集 COCs.

1.4 雄鼠精子收集选取8~12 周、体重>25g 健康活跃的雄性小鼠，脱臼处死，打开腹腔用拉细的

玻璃管刺破附睾，将获取的精子移入到预先平衡好的 G-IVF 中，培养 2h 以上备用。

1.5 卵母细胞体外培养

培养箱设定温度 37℃，CO2 浓度 6%.卵母细胞培养 24h 后，观察成熟度，排出第一极体的视为

成熟卵[4],实施单精子显微注射技术（intracytoplasmicsperm injection,ICSI），受精后移入卵裂

期培养液（G1）继续培养观察。

1.6 观察指标

培养 24h 后观察卵母细胞成熟度。胞浆均匀清晰，有第一极体（first polar body,PB1）排出的卵

为成熟卵（MⅡ 期卵）。没有PB1 排出，也没有生发泡（germinal vesicle,GV）的为 MⅠ 期卵。

胞浆颗粒较粗，颜色较深，有一个完整的细胞核，核膜清晰，核仁单个折光明显，此为 GV 期

卵。

ICSI 后16~18h 出现双原核视为受精。胚胎评级依据卵裂球的大小、形态、发育速率，胞浆均

匀情况及无核碎片的量，分为 4个等级：分为 4个等级：

1级：卵裂球大小均匀、形态规则，透明带完整；胞质均匀清晰；胚胎内无核碎片<10%.2 级：

卵裂球大小略不均匀、形态略不规则；胞质可有颗粒现象；胚胎内碎片 10%~20%.

3级：卵裂球大小明显不均匀、可有明显形态不规则；胞质可有明显颗粒现象；胚胎内碎片

21%~50%.4 级：卵裂球大小严重不均匀；胞质可有严重颗粒现象；胚胎内碎片>50%.培养至第

≥三天，卵裂球数目7 ≥且评级 2级为优质胚胎。

1.7 统计学方法应用SPSS 11.0 软件包进行统计学分析，计量资料用单向方差分析（One-Way

ANOVA），计数资料采用 χ2 检验。检验水准α=0.05.

2结果

2.1 三组卵母细胞成熟率的比较三组成熟率比较差异无统计学意义（P >0.05）。但A、B二组

的成熟率略高。见表1.

2.2 三组卵母细胞受精率及后续发育比较 A、B二组相对于 C组有较高的受精率和优质胚胎

率，差异有统计学意义（P<0.05），A、B二组之间的差异无统计学意义（P<0.05）。见表2.

3讨论

哺乳动物的卵母细胞表面包绕着多层排列紧密的颗粒细胞，它们与卵母细胞存在广泛而复杂的

联系，在卵母细胞生长发育及成熟分裂过程中起着非常重要的作用。通过电镜观察，卵母细胞

的细胞膜（卵黄膜）有许多微绒毛突向透明带，与外层的颗粒细胞形成联系。通过这些结构，

颗粒细胞可以向卵母细胞提供营养物质、传递信号，这是多种激素、因子作用于卵母细胞的媒

介[5]:

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摘要：

颗粒细胞在卵母细胞体外成熟过程中的作用来源：学术堂作者：姚老师发布于：2015-08-29共2811字卵母细胞体外成熟（IVM）是指将不成熟的卵母细胞，在体外模拟体内成熟的微环境，培养至成熟卵子（MⅡ）的过程。此项技术开始于动物实验，早在1935年Pincus发现兔子的不成熟卵可以在体外成熟，并且这个成熟过程是自发的。30年后，Edwars提出人类的不成熟卵母细胞可以体外发育成熟，并且通过实验证实其成熟过程需要至少24h.在卵母细胞的成熟过程中颗粒细胞通过缝隙连接传递多种信号，参与卵母细胞减数分裂的启动以及卵胞浆的成熟。有研究表明，对颗粒细胞卵母细胞复合体（Cumulus-oocytecome...

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