能在山羊乳腺特异表达的Tem－GFP转基因阳性细胞制备
能在山羊乳腺特异表达的 Tem－GFP 转基因阳
性细胞制备
来源：学术堂 作者：姚老师
发布于：2014-08-29 共3001 字
自Wilmut “ ”等获得体细胞核移植后代 多利 以来,体细胞核移植技术获得快速发展。Baguis 等
( 1999) 采用体细胞核移植技术首次获得了克隆山羊。此外,Keefer 等用外源基因转染的体细胞
为核供体,通过体细胞核移植方法获得转基因山羊。目前,利用体细胞核移植技术已成为制作转
基因动物的有效手段。为了建立通过山羊乳汁获得抗菌肽( Antimicrobial peptides,ABP) 的方法,
本研究利用在前期工作获得的中国林蛙皮肤 ABP 的真核表达载体 Tem-GFP-pBC1,转染山羊乳
腺上皮细胞以获得便于检测并能在山羊乳腺特异表达 Tem-GFP 的转基因阳性细胞。本研究进
一步开展通过体细胞核移植获得山羊乳腺特异表达 ABP 的转基因山羊的相关研究奠定基础。
1 、 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验用细胞 山羊乳腺上皮细胞( 由东北农业大学高学军教授馈赠)。
1.1.2 主要药品和试剂 SalI( TaKaRa) ; 脂质体 Lipofectamine 2000( invitrogen) ; 基因组 DNA 提取
试剂盒( TaKaRa) ; RNA 提取试剂 RNAiso plus( TaKaRa) 。
1.1.3 重组质粒 Tem-GFP -pBC1 利用前期工作中构建的重组质粒 Tem-GFP-pBC1,即在提取中国
林蛙皮肤抗菌肽 Temporin-1CEa mRNA 基础上, 通过反转录获得其 cDNA 。利用
cDNA、pEASY-T3 克隆载体和 GFP 基因构建获得山羊乳腺特异表达的重组质粒 Tem-GFP-
pBC1。
1.2 实验方法
1.2.1 山羊乳腺上皮细胞的传代 采用常规方法,将冷冻保存的山羊乳腺上皮细胞经解冻复苏后,在
二氧化碳培养箱中( 37 ℃,5% CO2,饱和湿度) 进行培养。当细胞达到 90%以上汇合时,进行传代
培养。
1.2.2 山羊乳腺上皮细胞的转染及转基因阳性细胞的筛选 采用王春生等方法, 用通过 SalI 单酶切
后线性化的重组质粒 Tem-GFP-pBC1 或者空载体 pEASY-T3( 对照组) 对山羊乳腺上皮细胞进行
转染,48 h 后, 利用含有 400 μg / mL G418( 预筛选的最佳浓度) 选择培养基进行转基因阳性细胞
筛选。
1.2.3 转基因细胞的鉴定 将上述获得的转基因阳性细胞进行传代培养,观察其细胞形态、生长曲
线、冷冻复苏后增殖特点等。此外, 根据基因组 DNA 提取试剂盒说明提取上述筛选获得的转
Tem-GFP-pBC1 的阳性细胞的基因组 DNA 。采用根据 Tem-GFP -pBC1 序列设计的引物( 5’-
TCAAGGAGGATG-GCAACA-3’ 和5’-GTGGACAGGTAGT GGTTATC-3’) 对细胞基因组 DNA
进行 PCR 检测。
1.2.4 转基因阳性细胞的 Tem-GFP 基因 RT-PCR 检测 根据 Genbank 中山羊 GAPDH 基因序列和
插入基因 Tem-GFP 序列, 利用 Oligo6.0 和Primer 6.0 软件, 分别设计 1 对RT-PCR 引物( GAPDH:
5’-AT-CACTG CCACCCAGAAGACT-3’ 和5’-CATGCCAGTGAGCTTCCCGTT - 3’; Tem -GFP:
5’-TCAAGGAG-GATGGCAACA-3’ 和5’-GTGGACAGGTAGTGGT TATC-3’) ; 采用 Trizol 法分
别提取转染前后细胞的总 RNA, 并经反转录获得 cDNA; 。聚合酶链式反应: 采用 25 μL 反应体
系进行, 反应混合物包括 10× buffer2.5 μL( 含MgCl2) ,cDNA1.5 μL, 引物各 0.5 μL,dNTP 0.5
μL,Taq 酶0.3 μL,ddH2O 19.7 μL。反应条件为: 94 ℃ 预变性 5 min,94 ℃变性 30 s,60 ℃复性 30
s,72 ℃延伸 30 s,30 个循环; 72 ℃延伸 10 min 后保存于 4 ℃。扩增结束后, 取5 μL PCR 产物于
1.0%琼脂糖凝胶进行电泳,并用凝胶成像系统记录结果。
2 、 结果分析
摘要：
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能在山羊乳腺特异表达的Tem－GFP转基因阳性细胞制备来源：学术堂作者：姚老师发布于：2014-08-29共3001字自Wilmut“”等获得体细胞核移植后代多利以来,体细胞核移植技术获得快速发展。Baguis等(1999)采用体细胞核移植技术首次获得了克隆山羊。此外,Keefer等用外源基因转染的体细胞为核供体,通过体细胞核移植方法获得转基因山羊。目前,利用体细胞核移植技术已成为制作转基因动物的有效手段。为了建立通过山羊乳汁获得抗菌肽(Antimicrobialpeptides,ABP)的方法,本研究利用在前期工作获得的中国林蛙皮肤ABP的真核表达载体Tem-GFP-pBC1,转染山羊乳腺上...
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