缺氧环境下体外培养髓核细胞的骨钙素变化

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缺氧环境下体外培养髓核细胞的骨钙素变化

来源：学术堂作者：周老师

发布于：2015-06-16 共3214 字

椎间盘由髓核、纤维环和软骨终板 3 部分组成，是人体中最大的无血管组织。四岁时椎间盘就

几乎没有任何血管，间盘营养严重减少，髓核细胞群随之发生明显变化，脊索细胞被更多的能

适应无氧环境的软骨细胞和纤维母细胞所代替；十岁时颈椎间盘已经成为一个无血管的组织，

其营养供应主要来自于软骨终板的渗透。软骨终板中央部分渗透性较周围部分高。软骨终板

中央部分有 1/3 区域可以渗透，而周围部分仅约 1/10 区域可以渗透；软骨终板在髓核处溶质

渗透占整个软骨终板的 85%, 在软骨终板接近内呈纤维环处下降到 35%,在软骨终板接近外层纤

维环界面处几乎完全不能渗透。椎间盘营养通路主要有终板途径和纤维环途径：椎体内的血

管不断分支，在软骨终板下骨质形成血管袢，包括氧气在内的绝大部分营养物质通过这些血管

袢经扩散作用透过软骨终板、椎间盘基质，最终到达内部的椎间盘细胞，而乳酸等代谢废物经

过相反途径排出，此即终板途径，Du 等通过动态增强 MRI 清楚观察到这一现象[1]; 小部分营

养物质通过分布到最外层纤维环的血管末梢来提供养分，即纤维环途径[2 -3]. 但随着机体的老

化，供应椎间盘周围的血管数量减少，软骨终板逐渐钙化，氧气等营养物质的供应及代谢废物

的排除受到阻滞，椎间盘内逐渐形成缺氧微环境。这种微环境对椎间盘退变的发生发展如何产

生影响，椎间盘退变是否与缺氧环境有关，这些都成为近年来学者们研究的重要课题。骨钙素

是骨转化的重要指标，能反应骨质疏松的状况[4]. 最近研究发现骨钙素参与诱导椎间盘软骨终

板的退变钙化过程，影响椎间盘退变[5]. 本实验拟通过体外培养髓核细胞，应用免疫学及组织

化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位的定性、定位或定量研究，判断

缺氧环境是否是骨钙素（ OCN ）变化的因素。

1 材料与方法

1. 1 主要试剂和仪器

永生化人髓核细胞株（上海拜力生物） ,基础培养箱，HF100 三气培养箱，骨钙素（ OCN ）

检测试剂盒（一抗，二抗，中杉金桥公司）, 磷酸盐缓冲液（PBS ）,4% 多聚甲醛试剂，曲拉

通X-100,H2O2 溶液，牛血清白蛋白（BSA ）,DAB 显色试剂盒，CKX31-A12PHP 倒置显微镜

（Olympus 公司）.

1. 2 免疫细胞化学染色检测髓核细胞常氧与需氧下 OCN 表达，采用免疫组织化学 SABC 法

制作髓核细胞爬片，于 37℃ 常氧培养箱，和模仿椎间盘缺氧（ 3% O2 ）条件的培养箱中培

养；于规定时间节点取出细胞爬片，PBS 缓慢洗涤 3 次，每次 5 min, 室温干燥；4% 多聚甲醛

固定20 min,PBS 缓慢洗涤 3 次，每次 5 min; 3%Triton-100 处理 20 min,PBS 缓慢洗涤 3 次，每

次5 min; 3%H2O2 处理 15 min,PBS 缓慢洗涤 3 次，每次 5 min; 山羊血清或者 BSA 封闭 2

h,PBS 缓慢洗涤 3 次，每次 5 min; 一抗（兔抗人OCN 单抗（1 200∶ ）） 4℃ 过夜封闭；将

玻片从4℃ 取出，室温复温 30 min,PBS 缓慢洗涤 3 次，每次 5 min; 室温孵育二抗（生物素标

记的羊抗兔 IgG 抗体） , 结合 2 h,PBS 缓慢洗涤 3 次，每次 5 min; 三抗（SABC ）封闭，室温

下结合 2 h,PBS 缓慢洗涤 3 次，每次 5 min; DAB 显色3 ~10 min,待细胞出现特异性染色后用水

洗涤，镜检；盐酸乙醇分化，氨水反蓝，镜检；脱水，封闭；拍摄，细胞核均染为蓝

色，OCN 表达阳性细胞胞质均染为棕色。

1. 3 免疫组化图像分析

用Image-Pro Plus （IPP ）6. 0 分析免疫组化图片，根据染色染料颜色的深浅（光密度）及分

布面积大小来确定目标蛋白的量。染色区域分布面积与目标蛋白量成正比。染色的颜色深浅

（光密度）与目标蛋白量的定量关系符合朗伯- 比尔定律，是对数关系。每张切片在高倍镜下

（×100 ）随机选取 8 个视野，应用图像分析系统进行半定量检测，结果以平均灰度值表示。

平均灰度值高（染色强度弱、透光度强）表示 OCN 表达水平低；反之则表示表达水平高。

平均光密度 OD 值（吸收光的物质的光学密度，与染色物质的量相关）高，表示 OCN 表达水

平高；反之则表示表达水平低。将图片上各点的光密度值累加起来，得到IOD. 此值与目标物

质的总量成正比。IOD 值除以细胞个数，得到单个细胞的 mean density, 此值反映了单个细胞

OCN 表达的水平。

1. 4 统计学处理

应用 SPSS 19. 0 统计学软件进行数据处理。检测数据以m ± s 表示，组间比较采用单因素方差

分析Tamhane's T2 检验，以 P <0. 01 为差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 生长曲线分析

检测结果见图 1 ~2 在培养 48、72 h 时，缺氧组髓核细胞较常氧组细胞增殖速度减缓>40%.

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缺氧环境下体外培养髓核细胞的骨钙素变化来源：学术堂作者：周老师发布于：2015-06-16共3214字椎间盘由髓核、纤维环和软骨终板3部分组成，是人体中最大的无血管组织。四岁时椎间盘就几乎没有任何血管，间盘营养严重减少，髓核细胞群随之发生明显变化，脊索细胞被更多的能适应无氧环境的软骨细胞和纤维母细胞所代替；十岁时颈椎间盘已经成为一个无血管的组织，其营养供应主要来自于软骨终板的渗透。软骨终板中央部分渗透性较周围部分高。软骨终板中央部分有1/3区域可以渗透，而周围部分仅约1/10区域可以渗透；软骨终板在髓核处溶质渗透占整个软骨终板的85%,在软骨终板接近内呈纤维环处下降到35%,在软骨终板接近外层...

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