微流控芯片中浓度梯度的形成及其运用探究

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微流控芯片中浓度梯度的形成及其运用探究

　　摘　　　　要：　在生物化学分析中系统研究样本与不同浓度组分间的相互作用是至关重要的。

微流控芯片技术能够在微米级的通道内完成精确的液体控制，近年来被普遍应用于生物化学分

析领域。微流控浓度梯度芯片是一种能够快速构建稳定生物化学浓度梯度的工具，能够与大多

数细胞培养、化学分析等技术相结合，为传统的生化分析提供新平台。本文综述微流控浓度梯

度芯片的形成机制及其在生物化学等领域的应用，为拓宽浓度梯度相关应用研究提供新思路。

　　　　 Abstract：　 It　is　important　to　systematically　study　the　interactions　between　samples　and　

different　concentrations　of　components　in　biochemical　analysis.　Microfluidic　chip　technology　has　been

widely　used　in　biochemical　analysis　in　recent　years,　because　it　can　realize　accurate　liquid　control　in　

micron-sized　channel.　Microfluidic　concentration　gradient　chip　is　a　tool　that　can　rapidly　construct　

stable　biochemical　concentration　gradient　and　can　be　combined　with　most　cell　culture,　chemical　

analysis　and　other　techniques,　offering　a　new　platform　for　traditional　biochemical　analysis.　Herein　the　

formation　mechanism　of　microfluidic　concentration　gradient　chip　and　its　application　in　biochemistry　

and　other　fields　are　reviewed,　thereby　providing　a　new　idea　for　broadening　the　application　research　

related　to　concentration　gradient.

　　 Keyword 　：microfluidic　concentration　gradient　chip;　drug　screening;　toxicity　analysis;　

chemotaxis;　materials　synthesis;　review;

　　前言

　　细胞的应激响应与多种生物过程紧密相关，微流控浓度梯度芯片能够构造与生理环境接近

的、具有浓度梯度刺激源的体外微环境，进而揭示生物体对不同生物化学刺激的响应，探究调

控细胞生物学行为的决定因素[1,2]。微流控浓度梯度芯片由于设计灵活易于调节的特点，能够

快速制备稳定的浓度梯度，实现高通量反应。得益于浓度梯度芯片微米级的通道尺寸，能够将

其集成到含有样品前处理与检测单元的微流控系统中。生物分子在体内的浓度梯度已经被证实

在癌症转移、伤口愈合以及生长发育过程中发挥重要作用[3,4]。基于微流控浓度梯度及芯片细

胞培养等技术，有助于实现细胞水平的药物筛选和趋化性以及毒性分析等研究。本文综述近 3

年浓度梯度芯片的开发及其在生物化学领域的应用研究。

　　 1 　、微流控芯片中浓度梯度的形成

　　 1.1　、微流控浓度梯度芯片的出现

　　宿主防御、创伤愈合、胚胎发生和癌症转移等生物学过程涉及许多可扩散化学物质的浓度

梯度[5]。浓度梯度和浓度排列在细胞生物学、趋化因子、生物化学、表面微加工等研究中的作

用也日趋重要。传统上，移液管、凝胶等主要用于稀释样品和研究细胞在浓度梯度作用下的行

为。然而，这些技术在生成复杂形状的空间稳定梯度时并不有效[6]。因此，迫切需要一种技术

来产生并维持可预测的长期复杂样品浓度梯度，用于检测样品浓度梯度与细胞应答之间的相关

性，实现高通量分析（如免疫分析和酶分析）和组合化学的高效多维筛选[7]。早在 2000

年，Jeon 等[8]提出微流控浓度梯度的概念，基于低雷诺数条件下层流扩散混合的原理设计了经

“ ”典的圣诞树模型且沿用至今，通过控制输入流体的相对流速，梯度的形状可以连续改变。这

一技术为研究依赖浓度梯度的生物化学现象提供了一个新平台[9]。近年来，包括层流扩散的微

流控网络在内的多种类型浓度梯度生成芯片被广泛用于高通量药物筛选[10]，化学物质毒性分

析以及趋化性研究且收获颇丰。微流控浓度梯度芯片的主要优势在于能够通过灵活的通道网络

设计形成不同形状的浓度梯度，适应需求，且能够维持浓度梯度的稳定。微流控浓度梯度芯片

的发展历程见图 1。

　　图1　微流控浓度梯度芯片的发展历程

　　 Fig.1　Development　history　of　microfluidic　concentration　gradient　chip

　　 a:Jeon 等[8] “ ”提出的圣诞树模型浓度梯度芯片；b “ ”：改进的手压式驱动的圣诞树模型浓度

梯度芯片[11];c：基于体积配比混合的新型微流控浓度梯度芯片[12];d：基于微混合构造的新型

微流控浓度梯度芯片设计[13];e：浓度梯度芯片在药物筛选中的应用[14]

　　 1.2　、微流控浓度梯度芯片的开发

　　 1.2.1　 “ ”、传统圣诞树模型的发展与改进

　　 “ ”多数基于浓度梯度芯片的应用仍旧沿用圣诞树模型，但从芯片的设计制造方面都做出了

较大的努力以更适用于特定的应用需求。Chen 等[15]采用有限元方法对双入口及 3入口的浓度

梯度发生器进行模拟，得到可控的任意近似线性曲线和任意二次方曲线的浓度分布，有助于不

同生化样本中细胞和分子的趋化性研究。类似地，Wang 等[16]介绍了采用激光加工微通道的方

式制备的一种聚甲基丙烯酸甲酯浓度梯度发生器，可产生近似线性和二次型浓度梯度曲线输

“ ”出。为了改进圣诞树模型注射泵进液的方式，Park 等[11]提出了一种通过按钮驱动的微泵单

元产生恒定体积的流体驱动样本，能够在两种不同的样品溶液之间产生 6种浓度的线性梯度，

该装置不需要外部泵，更利于其与微型装置（如 96 孔板）相集成，且流量可以通过手指按压

进行调整。该装置通过生成硝基苯磷酸底物的线性浓度梯度实现碱性磷酸酶的检测。Ebadi 等

[17]介绍了一种名为树状浓度梯度发生器设计工具的软件设计方法，这对于微加工、光刻和3D

打印制造的浓度梯度芯片有很大帮助。通过改变软件参数即可改变浓度梯度芯片输出的浓度分

布类型，且采用罗丹明-B 和食用染料的梯度形成实验验证了软件设计的可靠性。这对于大规模

的芯片设计与制造是有益的，能够提升高通量目标物筛选的效率。

　　大多数现有的浓度梯度芯片只能在微米大小的尺寸中产生所需的浓度梯度。Rismanian 等

[18]将改进的圣诞树模型与一个微混合器相结合，设计了一种能够在毫米大小尺寸中产生多种

试剂（如药物）的连续浓度梯度的芯片，实验证明该装置可以产生两种试剂的连续浓度梯度，

并将它们的所有可能的浓度组合传递到毫米大小的样品。Shimizu 等[19]提出了一种基于细胞外

基质的梯度发生器，构造了具有由组织流动产生的连续化学浓度梯度的培养表面，利用3D 打

印水溶性牺牲模具的牺牲成型技术，快速制备了含有梯度发生器和微混合器的明胶基微通道。

当荧光染料溶液被引入通道时，微混合器增强了两种溶液在连接处的混合。此外，通道中产生

的浓度梯度通过细胞外基质多孔性质的间隙扩散到器件的培养表面。在表面培养的人脐静脉内

皮细胞对微通道间质流产生的组胺浓度梯度做出了收缩反应，这表明该装置可以用于细胞对化

学刺激反应的基础生物学研究和药物体外实验平台。Hu 等[20]介绍了一种低成本的类似圣诞树

模型的浓度梯度芯片，采用热键合聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）技术分别制作了具有 2个和3

个进口的浓度梯度发生器，该方法可以在不同流速下产生不同的浓度梯度，微通道的结构设计

为S形左右对称，2进口和 3进口浓度梯度发生器的浓度梯度分布分别呈近似线性和二次曲

线。上述研究进展表明，在经典圣诞树模型基础上，针对具体应用对象需要调整浓度梯度生成

器的制造工艺、材质以及尺寸等参数，以便适应多场景的应用需求。

　　为了解决浓度梯度受流速影响的问题，Hoving 等[21]设计了一个改进的圣诞树状微流控通

道网络，输入流量可达200μL/min，最大速度约333　mm/s，比现有的报道入口流速高出两个数

量级，极大地扩展了应用领域。类似地，Martin　Cabaleiro 等[22]报道了采用3D 打印树脂制备

了类似圣诞树浓度梯度发生器。通过限制在连续流梯度发生器下的流速，在到达下一个分叉之

前在一个分支中实现完全混合，该浓度梯度生成器在低佩克莱特数下产生梯度的效果良好。此

外，该浓度梯度生成器在混合前实现精确试剂量配比，因而生成的浓度梯度形状与流速无关。

　　除了利用传统的微流控芯片材料[聚二甲基硅氧烷（PDMS）、PMMA、玻璃等]，纸基微

流控芯片也越来越成为研究热点。由于梯度的动态形成是基于化学物质在流体中的横向扩散，

在纸通道中分子的横向流动主要受机械扩散控制，这与分子扩散有本质区别，因此，在纸上设

计梯度发生器需要不同于传统微流体中使用的策略。Schaumburg 等[23]利用计算机模拟研究纸

基微流控浓度梯度发生器的优化设计，讨论 Whatman 滤纸浓度梯度芯片的设计与制备，建立

了二维平面纸和三维垂直纸两种新的金字塔网络模型。在纸和类似多孔基质中适当地利用机械

扩散会给纸基浓度梯度芯片带来巨大潜力。

　　 1.2.2 　、新型微流控浓度梯度芯片开发

　　 “ ”经典的圣诞树模型原理简单，因易于操作而具有广泛应用，然而其也存在通道冗长、梯

度形成时间长、梯度易受流速影响等缺点，因此，为克服上述问题，越来越多的新型浓度梯度

的设计被报道。Futai 等[24]开发了一种包含窄微通道的浓度梯度生成芯片，该窄通道具有适当

的流阻，既能满足试验物质的快速引入，又能长期保持梯度。该芯片能够保持Alexa 萤石荧光

染料浓度梯度至少48　h。生成和维持长期稳定的梯度是当前微制造系统的一个挑

战。Parittotokkaporn 等[25]开发了一个简单的流体驱动微流控系统，芯片采用聚二甲基硅氧烷

材质通过标准软光刻技术制备而成，在 1～10μL/h 低流量控制下产生荧光染料梯度，梯度在 1　h

内形成，在 2　h～5　d 内能够保持稳定。Shi 等[12]通过将 4组进样口（样品和缓冲液）依次连接

到主通道，确定进样口的位置和层流类型，建立浓度梯度。由于样本比例被事先分配好，因而

浓度梯度的产生只需要将样本充分混合即可，而不受入口流速的影响。从主通道引出9个微混

合通道，以有效地混合层流。将方波结构与微通道侧壁槽相结合，设计了一种比传统蛇形混合

通道混合指数更高的微混合通道。在流速为 2　280μL/min 情况下，按照快速微混合原理，线性

浓度梯度可在数秒内实现，且梯度形状与流速无关。

　　具有理想梯度的表面已被证明是一种强大的工具。Zhou 等[13]展示了一种新型的微流控网

络，可以在微流控通道内建立浓度梯度进行表面聚合或化学沉积，从而实现聚二甲基硅氧烷基

底上稳定的特征梯度。该芯片可用于制备底物在蛋白质吸附和纳米粒子固定化等多个领域，实

现生化分析与传感的实际应用。此外，Hong 等[26]提出了一种用于复杂网络拓扑结构微流控浓

度梯度发生器反设计的深度神经网络模型。该方法将浓度梯度和产生浓度梯度的设计参数分别

作为深度神经网络的输入和输出，并映射它们之间的关系。此外，他们提出了一种基于替代优

化和自适应采样的微流控浓度梯度发生器设计方法，以满足规定的浓度梯度[27]。在许多生化

实验中，控制特定位置的浓度梯度是至关重要的。Liu 等[28]基于聚二甲基硅氧烷的透气性，提

出了一种可调浓度梯度发生器，该发生器由气泡通道中的声学振荡气泡驱动，位置可控。浓度

梯度的调节可以通过改变气泡的数量和位置来实现。该器件制作简单、反应灵敏、生物相容性

好，特别适用于对时间可控性要求较高的生物学研究。

　　 2　、微流控浓度梯度芯片的应用

　　 2.1　、高通量药物筛选

　　微流控浓度梯度芯片由于可以在芯片内部建立起稳定的浓度梯度，且可以与 3D 细胞培养

技术相结合，因此越来越受到关注，被广泛地用于细胞水平的药物筛选研究。3D 细胞培养在

模拟体内肿瘤的结构和生理条件方面被认为更具临床意义。Lim 等[14]开发了一种带有细胞培

养装置的微流控浓度梯度发生器，可以使细胞形成球状体并在肿瘤药物梯度存在的情况下生

长。当结肠癌细胞成一个单一的球状体，球状体在癌症药物梯度伊立替康的存在下培养 3　d，

球状体的数量、圆度和细胞存活率与药物浓度成反比。这些结果表明带有细胞培养装置的药物

浓度梯度芯片有可能成为筛选肿瘤药物疗效的平台。2型糖尿病药物筛选的体外模型对制药业

至关重要。Luo 等[29]研制了一种基于微流控技术的环形药物浓度梯度芯片，并集成了胰岛素

瘤细胞系的 3D 培养。在高浓度葡萄糖作用下细胞的增殖，先是促进后抑制，胰岛素分泌功能

也在高浓度葡萄糖作用下先增强后抑制。这个模型可以帮助找到刺激胰岛素分泌的药物。Shen

等[30]开发了一种简单紧凑的微流控芯片，可以在大流量范围内快速构建多种溶质的 3个浓度

梯度，生成的 3个稳定、准确、可控的药物梯度可以评价对两种肿瘤细胞系（MCF-7 和Hep　

G2）的治疗效果。

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微流控芯片中浓度梯度的形成及其运用探究　　摘　　　　要：　在生物化学分析中系统研究样本与不同浓度组分间的相互作用是至关重要的。微流控芯片技术能够在微米级的通道内完成精确的液体控制，近年来被普遍应用于生物化学分析领域。微流控浓度梯度芯片是一种能够快速构建稳定生物化学浓度梯度的工具，能够与大多数细胞培养、化学分析等技术相结合，为传统的生化分析提供新平台。本文综述微流控浓度梯度芯片的形成机制及其在生物化学等领域的应用，为拓宽浓度梯度相关应用研究提供新思路。　　　　Abstract：　It　is　important　to　systematically　study　the　interactions　be...

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