DsbA在大肠杆菌中与人源胰蛋白酶-1融合表达

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DsbA 在大肠杆菌中与人源胰蛋白酶-1 融合表

达

胰蛋白酶( trypsin，EC 3. 4. 21. 4) 是丝氨酸蛋白酶家族的成员，是许多生物技术领域的工具

酶，如动物细胞培养过程，一些蛋白酶原活化过程等。在胰岛素的生物合成过程中，通常是以

胰岛素原的形式表达，然后在体外通过羧肽酶 B 与胰蛋白酶的特异性切割，转化为起作用的胰

岛素，但是目前所用到的胰蛋白酶大多数是从动物( 如猪、牛、羊等)的胰腺中直接提取，在此

过程中，有可能引入供体动物携带的致病微生物，所以急需重组胰蛋白酶的合成。在人体中，

主要存在两种胰蛋白酶原，即人胰蛋白酶原-1( trypsinogen-1 ，记为 PRSS1) 与人胰蛋白酶原-

2( trypsinogen-2 ，记为 PRSS2) ，二者约占人体内胰液总蛋白的 19% ，由于有研究报导 PRSS2

与人体的某些病理过程密切相关，所以本研究选择 PRSS1 作为研究对象，PRSS1 相对分子质

量约为 24kDa ，含有 247 个氨基酸，其中有 10 个Cys 。在其 N 端1 ～15 位氨基酸为胰蛋白酶

原表达信号肽，16 ～23 位的 8 个氨基酸残基( APFDDDDK) 是肠激酶的识别位点，也即胰蛋白

酶原活化肽( Trypsinogen acti-vation peptide，TAP) ，在体内可被肠激酶切割成为具有活性的胰

蛋白酶。Kiraly 等曾尝试在大肠杆菌中直接表达胰蛋白酶原，未发现有目的蛋白分泌，通过用

Met 代替信号肽后，有以包涵体形式出现的蛋白，Chen 等在研究胰蛋白酶原活化肽的功能时，

也用 Met 代替信号肽，可见，信号肽对于胰蛋白酶在大肠杆菌中的表达并非必须。若直接表达

胰蛋白酶，由于其能够特异性地在 Lys 与Arg 的C-端切割多肽，会对宿主造成很大伤害，也

大大降低了目的蛋白的表达水平。本研究借鉴前人融合蛋白表达的优势，将胰蛋白酶作为融合

蛋白表达。

二硫键形成蛋白 A ( Disulfide bond formationprotein A，DsbA) 最初是由 Bardwell 等于 1991 年

发现，存在于大肠杆菌周质胞腔内，主要负责催化新生蛋白质二硫键形成。DsbA 在胞内与目

标蛋白融合表达，有效地提高了目的蛋白的可溶性。

当然，不是所有的 DsbA 融合蛋白均能够得到可溶性的目的蛋白。人源胰蛋白酶-1 富含二硫

键，且在载体 pET-39b( + ) ( Novagen) 上含有催化二硫键形成的周质蛋白酶 DsbA 的基因，我

们将人源 Tryp-sin-1 的基因片段连接到 DsbA 的C- 端，利用 DsbA 与Trypsin-1 融合表达，预期

促进 Trypsin-1 蛋白中二硫键的正确折叠，实现目的蛋白的可溶性表达，并利用载体 pET-

39b( + ) 所携带的凝血酶的酶切位点来实现 Trypsin-1 的活化。

1 材料和方法

1. 1 材料

大肠杆菌 DH5α 与BL21( DE3) 感受态及 EasyPfu DNA polymerase 购自北京全式金生物技术有

限公司，载体 pET-39b( + ) 购自 Novagen，Trypsin-1 全基因为北京奥科鼎盛生物科技公司合

成。各种普通限制性内切酶为大连 Takara 有限公司产品; Fast-digest 内切酶与预染标准核酸相

对分子质量蛋白为 Fermaentas 公司产品; 质粒小量快速抽提试剂盒购自北京原平皓生物技术有

限公司; 琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒为北京博迈德科技发展有限公司产品;预染标准核酸相对分

子质量为康为世纪公司; 其余试剂为国产或进口分析纯。

1. 2 实验方法

1. 2. 1 Trypsin-1 全基因密码子优化和二级结构分析

不同宿主对同一氨基酸有不同的密码子偏好性，同时mRNA 编码区稳定性、外源蛋白的毒性

对外源蛋白在原核中表达也有重要的影响。按照 Codon usage 网站提供的 E ．coli 密码子使用

频率表，对人源 trypsin-1( GenBank Accession No ．NM_002769. 4) 的碱基进行优化设计，对密

码子使用频率低的氨基酸进行同义突变。有文献报导 mR-NA 二级结构的稳定性对翻译起始效

率起着至关重要的作用，进而影响蛋白的翻译，我们用 RNAstruc-ture 软件分析序列对应的

mRNA 的二级结构。

1. 2. 2 Trypsin-1 基因的扩增、克隆以及原核表达载体的构建

以含 Trypsin-1 基因的重组质粒pGH-trypain-1 为模板，设计引物进行PCR 扩增，正向引物序列

为5-aaaAGTACTATCGTTGGGGGCTATAACTG 反向引物序列为: 5-

ccgCTCGAGTTATTAGCTATTGG CAG-CA 。在正向引物和反向引物的两端分别引入 ScaI 和

XhoI 酶切位点。PCR 产物经纯化后用 ScaI 和XhoI 30 ℃ 酶切 2 h ，与同样经 ScaI 和XhoI 酶切

的pET-39b( + ) 质粒连接，连接产物转化大肠杆菌 DH5α 后采用菌落PCR 法和双酶切验证法筛

选阳性转化子克隆，并送测序公司进行测序确定。测序正确的阳性克隆转化子质粒pET39b-

trypsin-1 ，转入感受态大肠杆菌 BL21( DE3) 菌种。

1. 2. 3 重组 Trypsin-1 的诱导表达与 SDS-PAGE 分析

将pET39b-trypsin-1/BL21( DE3) 重组菌接入含 50 μg / mL 卡那霉素( Kan+) 的LB 培养基中于 37

℃ 培养活化过夜，次日按 V( 活化菌液) V( LB ∶培养基) =1 100 ∶ 转接至新鲜的LB 培养基

中，37 ℃ 培养至OD600 为0. 6 左右，加入诱导剂IPTG，24 ℃进行诱导，220 r/min 振荡培养

8 h。

取100 mL 菌液，以 8000 r/min ，在 4 ℃ 条件下离心 10 min 收集菌体，用溶液( 50 mmol/L Tris-

HCl100 mmol / L NaCl pH = 8. 0) 洗涤菌体 3 次后，离心并重悬菌体，17% 的功率超声裂解 20

min 。分别将裂解上清液、沉淀通过 SDS-PAGE 电泳分析，其中分离胶浓度为15%，浓缩胶浓

度为5% ，电泳后以考马斯亮蓝 R-250 染色，凝胶薄层扫描，分析目的蛋白表达情况。并尝试

不同的发酵温度、诱导剂量、诱导时机以及装液量，确定最适宜培养条件。

1. 2. 4 Trypsin-1 包涵体的复性

离心收集到的菌体，按1 L 发酵液所得菌体用 20 mL 50 mmol / L Tris-HCl 重悬，8 000 r /

min，4 ℃ 离心 5 min ，洗涤 3 次，然后用 20 mL 50 mmol/L Tris-HCl 重悬混匀，冰上放置 30

min，17% 的功率超声裂解 20 min，4 ℃，12 000 r/min 离心 30 min，弃掉上清，用包涵体洗涤

液( 3 mol/L 尿素，0. 6% Triton-X100，50 mmol / L Tris-HCl，4 mmol / L EDTA) 重悬沉淀，洗

涤30 min; 12 000 r/min 离心 30 min ，弃掉上清，用包涵体洗涤液再洗 1 次，离心弃上清; 沉淀

用5 mL 变性液( 50 mmol / L Tris-HCl，10 mol / L 尿素，40 mmol / L DTT，1 mmol / L EDTA)

充分溶解3 h，4 ℃ ，12 000 r / min 离心 30 min，回收上清; 将复性液( 50 mmol/L Tris-

HCl，150 mmol/L NaCl，10 mmol/LGSSG，5 mmol / L CaCl2) 缓慢加入到变性的蛋白溶液中，

至尿素终浓度为2 mol/L，4 ℃ 复性12 h。复性完毕后，以 50 mmol/LTris-HCl，5 mmol/L

CaCl2 缓冲液4 ℃透析。

1. 2. 5 Trypsin-1 活性测定

Trypsin 的活性定义为以 N-苯甲酰基-L- 精氨酸乙酯盐酸盐( BAEE ) 为底物，用 pH 值7.

8，0. 050 mol / L Tris-HCl 缓冲液配置 1. 0 mmol / L 底物溶液，光程1 cm ，反应温度 25 ℃，波

长253 nm 的条件下，OD 值递增 0. 001 min －1 ，为 1 个BAEE 单位。

酶活力单位( BAEE 单位) = ΔOD/t × 1000。

并以市售猪胰蛋白酶( 北京索莱宝科技有限公司) 为对照: 2. 5 g 猪胰蛋白酶和 0. 2 gEDTA 溶于

1 L PBS 中，不含钙和镁，含酚红，过滤除菌，－20 ℃ 保存，活性 250BAEE 单位mg －1。

取200 μL 复性蛋白液与 20 μL 凝血酶切割缓冲液( 10 × Buffer: 200 mmol/L Tris-HCl，pH = 8.

4，1. 5 mol / L NaCl，25 mmol / L CaCl2) 混合，加入1 μL 凝血酶，室温酶切后取 200 μL 酶切

溶液测定其活性。

2 结果

2. 1 Trypsin-1 基因表达质粒的构建

构建的重组表达质粒pET39b-Trypsin-1，经菌落PCR ［图 1a) ］和双酶切［图 1b) ］验证，得

到678 bp 左右的特异性扩增条带，经测序验证，结果显示与所要构建的目的基因片段完全一

致。【图 1】

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摘要：

DsbA在大肠杆菌中与人源胰蛋白酶-1融合表达胰蛋白酶(trypsin，EC3.4.21.4)是丝氨酸蛋白酶家族的成员，是许多生物技术领域的工具酶，如动物细胞培养过程，一些蛋白酶原活化过程等。在胰岛素的生物合成过程中，通常是以胰岛素原的形式表达，然后在体外通过羧肽酶B与胰蛋白酶的特异性切割，转化为起作用的胰岛素，但是目前所用到的胰蛋白酶大多数是从动物(如猪、牛、羊等)的胰腺中直接提取，在此过程中，有可能引入供体动物携带的致病微生物，所以急需重组胰蛋白酶的合成。在人体中，主要存在两种胰蛋白酶原，即人胰蛋白酶原-1(trypsinogen-1，记为PRSS1)与人胰蛋白酶原-2(trypsinog...

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