DNA第三代测序技术的应用探究

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DNA 第三代测序技术的应用探究

　　摘　　　　要：在自然界中，生物 DNA 的碱基序列包含着生物体中绝大多数的遗传信息，破

译这些碱基序列就成了探索生命奥秘的至关重要的课题。随着第二代测序技术(Next-Generation

Sequencing，NGS)的发展和应用，其弊端正在显现，而第三代单分子测序技术在一定程度上可

以弥补 NGS 技术在应用中的一些不足。本文阐述了第三代单分子测序技术的 2个测序原理，

介绍其在基因组、转录组、表观遗传学等方面的应用现状，同时对其未来发展进行展望。

　 Abstract： In nature, the base sequence of biological DNA contains most of the genetic

information in the organism, so how to decipher these base sequences becomes a crucial issue in

exploring the mysteries of life. With the development and application of Next Generation Sequencing

Technology (NGS), some of his drawbacks are emerging. The third-generation single-molecule

sequencing technology can make up for some shortcomings in the application of next-generation

sequencing technology to a certain extent. This article describes the two sequencing principles of the

third-generation single-molecule sequencing technology and introduces its application in the research

of genome, transcriptome, epigenetics, etc., and looks forward to its future development direction.

　　 Keyword： The third generation sequencing technology; Principle; Biology; Application;

随着生物信息学的快速发展，DNA 测序技术在不断创新。第一代测序技术，即 Sanger 的链终

止方法[1]于1977 年登上历史舞台，其主要应用于人类基因组（HGP）计划，人们耗时 15 年花

费了 30 亿美元完成了首个人类基因组图谱。尽管一代测序读长可达 1 000 bp、精确度高达

99.999%，但测序通量低、成本高等缺点限制了它的大规模应用。直到 21 世纪初，以高通量为

主要特点的第二代测序技术（又称为下一代测序技术，Next-Generation Sequencing，NGS）的

开发，如 Roche 公司的 454 技术、Illumina 公司的 Solexa 技术和 ABI 公司的 SOLID 技术[2]，使

成本从 HGP 的1亿美元 1个基因组下降到 2015 年底的 1 000 美元 1个基因组，并且测序时间大

幅缩短，成功地把 DNA 测序引入到了高通量测序时代，同时也把研究方向从单个基因位点扩

展到全基因组研究的水平层面，并从人类应用扩展到各种生物的研究中。然而由于第二代测序

技术存在读长过短、引入 PCR 扩增错误、具有 GC 偏好性等缺点，不能够完全满足人们对于全

基因组测序的需求。随着人们继续研究高通量测序技术，以单分子测序为技术特点的第三代测

——序He-licos 单分子测序仪、Pacific Bioscience 的SMRT 技术和 Oxford Nanopore Technologies

公司的纳米孔单分子测序技术登上了 DNA 测序技术的舞台。与第二代测序的核心原理，即边

合成边测序相比，第三代测序技术的特征在于单分子测序，即不需要 PCR 扩增，这就避免了

PCR 扩

1 　、第三代测序技术的方法及其原理

　　 1.1 　、Pacific　Bioscience　SMRT 技术

从测序手段来看，PacBio 测序是基于光信号的三代测序技术，PacBio 测序可在目标 DNA 分子

复制的过程中捕获序列信息（即边合成边测序）。PacBio 测序使用一种被称为 SMRTbell 的模

板，这是一个通过将发夹接头序列连接到目标双链 DNA 分子两端而形成的单链环状DNA 分

子。当SMRTbell 通过被称为 SMRT cell 的芯片上时，SMRTbell 会扩散到被称为零模式波导

（Zero-Mode Waveguide，ZMW）的测序单元中，每个SMRT cell 中含有 15 万个零模式波导

管。ZMW 是一种直径仅为几十纳米的纳米孔，每个ZMW 底部都固定有聚合酶，可以与

SMRTbell 的任一发夹接头序列结合并开始复制。SMRT cell 中添加有4种不同荧光基团的核苷

酸，不同荧光基团被激活时会产生不同的发射光谱。当一个碱基与聚合酶结合时，便会产生一

个光脉冲被记录下来，根据光的波长和峰值便能够识别这个碱基[3]。PacBio 测序的一个关键是

将反应信号与游离碱基的荧光背景区别出来，因为 ZMW 的孔径小于波长，从底部打上去的激

光不直接通过孔径，但是可以在孔径处发生光的衍射，仅仅能够照射 ZMW 的底部区域。而

DNA 聚合酶就锁定在底部的这个区域，只能被碱基携带的荧光团激活并检测到发光，从而大

大减少了背景荧光的干扰。PacBio 测序的另一个关键是聚合酶的活性，它决定了测序的长

度。DNA 聚合酶的活性会在激光照射下逐渐减弱，因此不能无限长度的进行合成反应，所以

DNA 链的测序长度是有限的。此外当存在如甲基化之类的碱基修饰时，相邻碱基的测序时间

会变长，因此可以通过测定相邻2个碱基的测序时间来检测碱基修饰。碱基携带的荧光基团可

以被激活并被检测到，从而减少背景荧光的干扰。PacBio 的测序速度很快，然而，这种测序方

法的错误率（可达到 15%）远高于二代测序，不过因为出错随机，可通过增加测序深度来有效

纠正测序错误。

　 1.2　、纳米孔单分子测序技术

与基于光信号的 PacBio 测序不同，纳米孔单分子测序技术(The Single-Molecule Nanopore DNA

Sequencing)的实质是利用电信号测序的技术，其原理是纳米孔内有共价结合的分子接头，当单

个碱基或DNA 分子通过纳米孔通道时，会使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电

流强度。由于化学结构的差异，A、C、G和T这4种不同碱基通过纳米孔时会产生不同强度的

电流，通过灵敏的电子设备可以检测到电流变化，进而可以识别 DNA 链上的碱基完成测序。

与上述 PacBio 测序方法相比，纳米孔单分子测序技术处理样品非常简单，也不需要脱氧核糖

核苷酸，这也表明该测序方法的便宜性。然而，纳米孔单分子测序技术也有缺陷，由于 DNA

通过纳米孔极其迅速，极可能引起电流特征性变化不明显，从而降低测序的准确度，故将单个

核苷酸通过孔的速度降低则成为了这个技术拟解决的难题，与 PacBio 测序类似，纳米孔单分

子测序的碱基错误率也远高于二代测序。

　 2　、第三代测序技术的应用

　　 2.1 　、在基因组方面的应用

　　 2.1.1 　、从头组装

获得一个物种的基因组对相关研究者具有十分重要的意义，二代高通量测序的发展使得诸多物

种的基因组从头组装（De novo assembly）成为现实。然而由于许多生物学和技术上的原因，

特别是重复或杂合序列、测序错误、嵌合读码、读长不足或读码覆盖不全或有偏差等因素[4]，

造成高质量的基因组组装具有很大挑战性。在这些限制因素中，最突出和最具挑战性的便是重

复序列，二代测序技术因为读长过短(只有50~500 bp)在鉴别重复元素等方面存在固有的局限

性。三代测序的长读长(10 kp 以上)克服了二代测序的这些限制，因此利用三代测序产生的长读

长进行从头组装成为三代测序的主要应用方面[3]。

2016 年，Shi 等[5]用单分子实时(SMRT)测序对中国人个体 HX1 进行测序，构建物理图谱，生

成2.93 Gb 的从头组装数据集，为中国个体生成了第一个近乎完整的从头组装基因组，该基因

组填补了人类参考基因组 GRCh38 中274 个(28.4%)空白，与 GRCh38 相比，发现了 12.8 Mb 的

HX1 特异性序列，包括在先前报道的亚洲人基因组中不存在的 4.1 Mb 序列。2018 年，Adam

Ameur 等[6]也使用 SMRT 测序对 2个瑞典人基因组进行了重新组装，研究发现每个个体中有超

过10 Mb 的序列从人类参考基因组 GRCh38 中缺失，而且大约有6 Mb 的新序列是与中国人的

个人基因组（HX1）共有的。这些研究结果表明了GRCh38 参考基因组还不完整，同时证明了

三代测序在复杂基因组的组装上具有独特的优势，能够发现诸多二代短读长测序遗漏的基因组

信息。

目前三代测序除了应用在人类基因组的从头组装上，也已经用在水稻[7]、小麦[8]、猪[9]、鸡

[10]、牛[11]、羊[12]等具有重大经济价值的动植物基因组的从头组装上。

　 2.1.2 　、结构变异检测

结构变异(Structural Variation，SV)包括拷贝数变异、插入、删除、易位以及这些事件的组合

等，SV 已被证明对许多物种的进化、基因组疾病、基因调控和其他表型等有重大影响[13]。与

单核苷酸多态性（SNPs）相比，SV 的情况复杂得多，因此更难以检测和识别。由于二代测序

长度较短，检测出的SV 具有低灵敏度和假阳性率高的特点，对这些复杂SV 的研究有很大的

局限性，尤其是涉及重复区域的结构变异研究。而三代测序产生的读长平均长度远大于二代测

序产生读长，大大有利于结构变异的检测。Couldrey 等[14]利用PacBio 长读长测序和 Illumina

测序检测和评估新西兰奶牛的拷贝数变化，研究表明这种长读长测序对于 CNV 的检测是一个

理想的平台，将最终有助于改进基因组预测。

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摘要：

DNA第三代测序技术的应用探究　　摘　　　　要：在自然界中，生物DNA的碱基序列包含着生物体中绝大多数的遗传信息，破译这些碱基序列就成了探索生命奥秘的至关重要的课题。随着第二代测序技术(Next-GenerationSequencing，NGS)的发展和应用，其弊端正在显现，而第三代单分子测序技术在一定程度上可以弥补NGS技术在应用中的一些不足。本文阐述了第三代单分子测序技术的2个测序原理，介绍其在基因组、转录组、表观遗传学等方面的应用现状，同时对其未来发展进行展望。　Abstract：Innature,thebasesequenceofbiologicalDNAcontainsmostoft...

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