核酸扩增中离心微流控芯片技术的应用

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核酸扩增中离心微流控芯片技术的应用

　　摘　　　　要：常规聚合酶链式反应对反应条件的要求很高，需要在多个温度下进行循环，而

核酸等温扩增仅需在恒定温度下就能进行核酸的高效快速扩增。离心式微流控芯片技术具有微

型化、集成化、高通量、自动化等优势，可实现实时、低成本生化检测分析。本文介绍了离心

微流控芯片技术在核酸扩增前处理和核酸等温扩增中的应用，主要包括核酸提取、试剂预存储

和核酸等温扩增等方面，并且对离心微流控芯片技术用于核酸等温扩增中存在的问题与未来的

发展方向进行分析讨论。

　　　关键词：离心微流控; 核酸提取; 核酸等温扩增; 实时检验;

　　 Abstract： Conventional polymerase chain reaction requires high reaction conditions and

needs to be cycled at multiple temperatures,while isothermal nucleic acid amplification only needs to

perform efficient and rapid nucleic acid amplification at a constant temperature. Centrifugal

microfluidic chip technology has the advantages of miniaturization,integration,high

throughput,automation,etc.,and can realize real-time,low-cost biochemical detection and analysis. In

this paper,the applications of centrifugal microfluidic chip technology in the pre-processing of nucleic

acid amplification and nucleic acid isothermal amplification were introduced,mainly including nucleic

acid extraction,reagent pre-storage and nucleic acid isothermal amplification. Furthermore,the

problems existing in the application of centrifugal microfluidic chip technology in nucleic acid

isothermal amplification and the future development direction were analyzed and discussed.

　　 Keyword： centrifugal microfluidic; nucleic acid extraction; isothermal nucleic acid

amplification; real-time detection;

食品安全在现代社会引发越来越广泛的关注，出现许多由食源致病菌的污染食品造成频发的食

品安全事件，而早期对致病菌进行分子诊断可有效防止后期产生严重损害。在致病菌检测早

期，标志物的检测水平通常非常低[1]，需要采用核酸扩增技术来扩增脱氧核糖核酸(Deoxyribo

Nucleic Acid,DNA)和核糖核酸(Ribonucleic Acid,RNA)，拷贝大量目标核酸，显着提高反应灵敏

度[2]。核酸扩增技术包含常规聚合酶链式反应[3](Polymerase Chain Reaction,PCR)、核酸等温扩

增等技术。其中，核酸等温扩增技术操作简单，仅需要一个恒温平台，便能使样品进行高效、

快速的核酸扩增反应，但仍需要专业的检测人员操作，不宜在现场及基层推广[4]。

微流控技术是将传统实验室的基本功能整合到一个只有几平方厘米的芯片上，仅通过皮升或微

升体积的微量流体，便能实现生化分析的各个步骤。此方法具有微型化、集成化、高通量、自

动化的优势，为实现现场检测、低成本的生化分析提供了一条经济简便的检测技术途径。目前

微流控检测芯片已广泛应用于血液检测[5,6]、药物筛选[7,8]、核酸分析[9,10]、水质分析[11,12]

及食品检测[13,14]等方面。微流控芯片的驱动方式分为机械驱动及非机械驱动。机械驱动主要

是利用自身部件的运动来达到驱动的目的，包括各种微泵驱动[15]、磁珠驱动[16]和离心力驱

动[17]等，非机械驱动方式包括毛细管作用力驱动[18]，电动驱动[19]等。离心力驱动芯片是机

械驱动中的一种，与微泵驱动、磁珠驱动等机械驱动的不同在于，其不需要连接外部任何其他

接口，可实现分析系统的集成性及简便性。由于离心重力场的作用，离心式芯片可以简便去除

可能干扰测定的任何气泡，并且通过调节通道的长度及旋转速度，实现不同大小的离心力，仅

通过简单主轴电机即可驱动数十或者数百个独立的结构单元，可在芯片上对样品进行分子诊断

及检测分析[20]。

近年来，越来越多的研究表明将离心微流控芯片技术与核酸等温扩增技术结合，具有微量化、

集成化、自动化等特点，在食品安全、环境保护、医疗卫生等领域展现巨大的发展潜力。本论

文介绍了离心微流控芯片技术用于核酸等温扩增的研究进展，包括离心微流控芯片技术用于核

酸提取、试剂的预存储，重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)、环介

导等温扩增(Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP)、依赖核酸序列扩增(Nucleic Acid

Sequence-dependent Amplification,NASBA)三种核酸等温扩增方法中的应用。最后，对离心微流

控技术用于核酸等温扩增存在的问题和可能的发展方向进行了分析。

1　、离心微流控芯片技术用于核酸扩增前处理

　　 1.1　、核酸提取

在进行核酸扩增检测之前，首先要进行样品中的核酸提取。提取样品中的核酸，真核细胞或细

菌需要进行裂解，使核酸易于纯化或浓缩，提取高质量的 DNA、RNA 是检测成功的关键

[21,22,23,24]。离心式芯片上 DNA 的提取及纯化常采用磁珠或二氧化硅珠机械裂解法。该方法

需要三个主要步骤:样品 DNA 与珠子相的结合、珠子洗涤以及DNA 纯化、DNA 的洗脱。

STUMPF F 等[25]使用磁珠在芯片上进行核酸提取，磁珠为固定相。如图 1A 所示，将磁珠预存

储于芯片腔室(c)中，并将结合液、裂解液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液通过铝复合箔棒状包

装预存储于(b)从右至左的五个不同腔室内。样品从进样腔(a)加入，在电机频率为55 Hz 的条件

下将裂解液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液 RNA 提取缓冲液从棒状包装中释放出并分别转移至

裂解结合腔(c)、洗涤腔 1(d)和洗涤腔 2(e)和洗脱腔(f)。调节转速为 80 Hz 将结合液包装破裂并

添加至裂解结合腔(c)裂解样品中，使 RNA 与磁珠结合。通过使用外部移动磁铁的方法依次通

过核酸提取腔室(c-f)得到纯化后的 RNA。最后提取出纯化后的 RNA 驱动到微流体通道区域(g)

中，使用 10 Hz 的频率使洗脱液泵送到等分结构(h)中，然后转移至反应腔(i)中进行后续扩增检

测。

另一方法，使用二氧化硅珠以提取核酸，硅珠为固定相。JUNG J H 等[26]研究出将硅珠以低凹

结构填充在微通道中，不论旋转速度和方向如何，这种珠床都是固定的。如图 1B 所示，将样

品加入进样腔(a)中，由于芯片的亲水性，样品自动流入含有硅珠的微通道(b)中，硅珠将 RNA

样品及一些杂质捕获。洗涤液、洗脱液和 RT-LAMP 反应混合液分别装入洗涤腔(c)、洗脱腔(d)

及RT-LAMP 存储腔(e)，以5 000 r/min 的速度离心 10 s，先释放洗涤液，去除残留在硅珠上的

盐、蛋白质，通过虹吸阀的设计再释放洗脱液，洗脱硅珠上纯化后的 RNA，然后以5 000 r/min

的速度逆时针离心 290 s 完全干燥微珠中的任何残留乙醇，核酸提取的废弃液体由驱动力移动

至废液腔(g)。将驱动设备停止30 s，在进样腔(a)中加入无核酸酶水，RT-LAMP 存储腔(e)中的

反应混合液释放至虹吸阀，以5 000 r/min 的速度顺时针旋转 90 s，纯化后的 RNA 与RT-LAMP

混合液转移至反应腔(f)并进行后续扩增检测。离心式芯片需要精密设计的微通道和腔室才能够

仅通过主轴电机进行核酸的提取及纯化。

1.2　、试剂的预存储

试剂的预存储能够有效避免来自不同生产批次的试剂的混合，有助于减少交叉污染，增强检测

效果，减少在检测过程中手动添加试剂。预存储可细分为干燥试剂和液体试剂的存储，由于预

存储试剂(例如缓冲液和溶剂)需要低温、隔氧、避光保存等性质，其长期预存储是一个巨大的

挑战。

使用干燥形式进行试剂的预存储，通常是在芯片封装之前将预存储试剂添加到聚合物芯片反应

室内，然后将试剂进行冷冻干燥，之后再对芯片进行封装。通过优化合适的冷冻干燥参数，冻

干试剂能够长期在室温下稳定存储。对于液体试剂，可以预先存储在单独的容器中，也可以直

接注入离心式芯片的腔室中。STUMPF F 等[25]提出了由不透气的铝复合箔制成微型包装，能

够在制造过程中改变微型包装的密封参数，实现在不同的离心力下分批次破裂释放缓冲液，可

用于 PCR 试剂补充液或缓冲液的释放(图1C)。LUTZ S 等[27]证明了用于 DNA 提取的液体试剂

的长期稳定预存储。将 RPA 缓冲液封装在玻璃包装中进行密封，然后将其放在芯片内。当进

行检测时，首先将玻璃瓶手动压碎将试剂释放到微流体结构中，再进行后续检测(图1D)。

　 2　、离心微流控芯片技术用于核酸等温扩增

核酸等温扩增技术能够使用恒定温度对 DNA、RNA 进行扩增，操作过程较 PCR 技术简单很

多，在现场检测的研究中展现出良好的应用前景。下面介绍离心微流控芯片技术在重组酶聚合

酶扩增(RPA)、环介导等温扩增(LAMP)、依赖核酸序列扩增(NASBA)三种核酸等温扩增方法中

的应用。

　 2.1　、重组酶聚合酶扩增(RPA)

重组酶聚合酶扩增(RPA)仅需要一种能够结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶，单链 DNA 结

合蛋白(SSB)与被取代的 DNA 链结合，DNA 聚合酶在室温或 37℃的最佳温度下均能进行具有

活性的链置换反应[28]。反应的第一步是在重组酶和引物之间形成复合物，该复合物与双链

DNA 中同源序列的互补 DNA 结合。一旦引物与同源序列结合，就会发生链交换反应，启动

DNA 合成，并以指数方式扩增模板上的靶区域，取代的 DNA 链与 SSB 结合以防止进一步取代

[29]。在该系统中，合成反应由两个相对的引物引发，整个过程在10 min 内获得可检出水平的

扩增产物。这种方法由于反应温度相对较低，不会出现液体蒸发的问题。

图1 离心式微流控芯片的前处理

(A)磁珠吸附法[25](B)二氧化硅吸附法[26](C)铝复合箔包装[25](D)玻璃包装[27]

CHOI G 等[30]，研发出集成性的离心式芯片及配套检测仪器。能够在单个离心式芯片中进行

牛奶细菌的裂解，试剂的精准分装，RPA 扩增以及实时荧光检测。单个离心式芯片包含一式三

份相同功能单元，每个单元含有四个反应腔;每部分芯片由两层组成，包括 RPA 试剂注入顶层

和含有食源性致病菌的加标牛奶样品装入底层。芯片的操作流程如图 2A 所示:首先将细菌样品

添加到芯片的样品入口(a),RPA 试剂添加至试剂入口(b)，通过 800 r/min 转速使细菌样品进入等

分腔(c)将样品等分为四份，再调节至 3 000 r/min 转速，顶层的 RPA 试剂通过微通道流入至缓

冲液腔(d)。最终以 5 000 r/min 的速度将等分腔(c)中的细菌样品和缓冲液腔(d)的RPA 试剂同时

加载到每个反应腔(e)中混合，再进行 RPA 扩增后续检测。此方法可以在39℃恒温 30 min，通

过荧光变化同时检测牛奶样品中三种食源致病菌，并且可直接对样品进行检测无需提取

DNA。

CHEN J 等[31]，研发出一种便携式过滤移液器，可从尿液样本中检测出五种不同的致病菌。芯

片的操作流程如图 2B 所示:首先将磁力搅拌子与氧化锆珠预封装于芯片裂解腔(b)内，通过芯片

的入口(a)将细菌悬浮液添加到裂解腔(b),RPA 混合溶液添加至储存腔(c)中，并将所有的进出口

都用胶带密封。随后把芯片放在定制的磁力搅拌器上，用芯片磁珠裂解法将细菌裂解。其次

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摘要：

核酸扩增中离心微流控芯片技术的应用　　摘　　　　要：常规聚合酶链式反应对反应条件的要求很高，需要在多个温度下进行循环，而核酸等温扩增仅需在恒定温度下就能进行核酸的高效快速扩增。离心式微流控芯片技术具有微型化、集成化、高通量、自动化等优势，可实现实时、低成本生化检测分析。本文介绍了离心微流控芯片技术在核酸扩增前处理和核酸等温扩增中的应用，主要包括核酸提取、试剂预存储和核酸等温扩增等方面，并且对离心微流控芯片技术用于核酸等温扩增中存在的问题与未来的发展方向进行分析讨论。　　　关键词：离心微流控;核酸提取;核酸等温扩增;实时检验;　　Abstract：Conventionalpolymerasech...

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