基因修饰红细胞输送左旋天门冬酰胺酶的体系构建

3.0 闻远设计 2024-04-20 31 4 641.06KB 7 页免费

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基因修饰红细胞输送左旋天门冬酰胺酶的体系

构建

左旋天门冬酰胺酶（L-asparaginase，L-ASNase）是治疗淋巴细胞白血病等恶性血液病的重要药

物之一。某些类型的肿瘤细胞表达的 L-天门冬酰胺合成酶（L-asparagines synthetase，L-AS）

活性远远低于正常细胞，难以在胞内将氨或 L-Glu 的酰胺基在 ATP 和Mg2+存在时有效地转移

至L-Asp 的β羧基生成 L-Asn，因而迫使这类肿瘤细胞利用外源 Asn 以维持胞内蛋白质合成与

细胞增殖；而 L-ASNase 可水解 Asn（必需氨基酸）为 Asp 和氨，由于人体内不存在天然 L-

ASNase，若向患者体内引入 L-ASNase，全身性降解 Asn，可使这类肿瘤细胞因 L-AS 活性低，

不能独立合成 Asn，造成 Asn 饥饿，导致蛋白质的生物合成紊乱而死亡，达到在不影响正常细

胞生理功能的前提下杀伤肿瘤细胞的目的。但 L-ASNase 是异源酶，免疫原性易致人体产生灭

活酶的抗体，且不良反应较大，因此亟待研发低免疫原性 L-ASNase 给药方案。目前有临床试

验将 L-ASNase 用急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）复发患者的自体

红细胞（red blood cell，RBC）封装后再自体回输，该给药方案在理论上可消弱 L-ASNase 的抗

原性，阻碍治疗性酶被宿主蛋白水解酶降解；在临床上也观察到可降低 ALL 复发患者抗-L-

ASNase 抗体的形成，明显减弱过敏反应、凝血功能障碍和肝功能失常，改善了病患的健康状

况。然而，这种用非基因修饰方法将药物封装进 RBC 的方案或多或少均改变了 RBC 的形态和

细胞膜特征（如易碎、变形性下降等），增加了机体清除这部分 RBC 的机率。

由于造血干细胞在体外向红细胞定向分化需时较长，若向造血干细胞中引入 L-ASNase 基因，

可以使其在定向分化过程中开始表达 L-ASNase，克服红细胞生命力短暂、难以在体外长期存

活之弱点，延长药物时效，为寻找合适的分化期导入体内遏制 ALL 奠定基础。

在本研究中，我们用携带 L-ASNase 的红细胞特异性重组慢病毒载体系统包装出自灭活（self-

inactivation，SIN）重组慢病毒，以小鼠红白血病（murineerythroleukemia，MEL）细胞经诱导

可向红细胞终端分化为模型，探讨重组慢病毒感染后MEL 细胞在分化过程中表达 L-ASNase 目

的基因，延长药物时效的可行性。

1 、材料与方法

1.1 材料

人胚胎肾（human embryonic kidney，HEK）293T 细胞、MEL 细胞、小鼠成纤维细胞 NIH/3T3

和稳定表达对照病毒 RRL-sEF1α-GFPLuc 的NIH/3T3 细胞、人宫颈癌 HeLa 细胞为本课题组保

存；大肠杆菌 DH5α、包装质粒psPAX2、包膜蛋白质粒pMD2.G 、转移质粒RS9-L-ASNase-

2A-mCherry-PGK-MGMT-HS4-IVS2（-）、RRL-sEF1α-L-ASNase-2A-mCherry 和RRL-sEF1α-

2A-mCherry 为本课题组保存。

各种限制性内切酶为 New England Biolabs 公司产品；DMEM 培养基、AIM-V XIVIVO-5 培养

基、胎牛血清（FBS）为 Invitrogen Gibco 公司产品，O6-苄基鸟嘌呤（O6-

benzylguanine，BG）、双氯乙亚硝脲［1，3-bis（2-chloroethyl）-1-nitrosourea，BCNU；商品

名为卡莫司汀］、六亚甲基二乙酰胺（N，N'-hexamethylene bisacetamide，HMBA）、聚乙烯

亚胺（polyethylenimine，PEI）和聚凝胺（polybrene ）为 Sigma 公司产品；兔抗大肠杆菌 L-

ASNase 多抗为 GeneTex 公司产品；小鼠抗mCherry 单克隆抗体为 EarthOx 公司产品；青霉素

和链霉素溶液（以下简称双抗）为 Hyclone 公司产品；InstaGene Matrix 为Bio-Rad 公司产品；

荧光定量（TaqMan ）快速 PCR 混合试剂盒（2× ）为 ABI 公司产品；哺乳动物细胞总蛋白抽提

试剂（mammalian protein extraction reagent，M-PER）、2，2-联喹啉-4，4-二甲酸二钠

（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量分析试剂盒为Pierce 公司产品；辣根过氧化物酶标记的

山羊抗兔IgG 和键合了 Alexa 488 的山羊抗兔IgG 为Affinity Biologicals 公司产品；标准品 L-

ASNase 为日本协和发酵麒麟株式会社产品。

1.2 慢病毒转移载体的设计和制备

RS9- L- ASNase- 2A- mCherry- PGK- MGMT-HS4-IVS2（-）的结构（图1）中，为方便监测目

的基因的表达，将编码 L-ASNase 的cDNA 通过2A 联接体技术与编码红色单体荧光蛋白

mCherry 的cDNA 连接，同受 β-珠蛋白启动子（promoter，P）、β-珠蛋白 3'端增强子

（enhancer，E）和 β-珠蛋白位点控制区（locuscontrol regions，LCR）DNaseⅠ 高敏位点

（hypersensitive site，HS）中具有较强增强子活性的 HS2 和具有染色质开放活性的 HS3 调

控。2A 为源于一点褐翅蛾病毒的 2A 短肽（Thosea asigna virus 2A，T2A），当核糖体快速处

理2A 肽C端甘氨酰- 脯氨酰之间的肽键合成时，会引起2A 肽与其下游肽之间发生自裂解，该

序列允许在同一读框中通过2A 的自裂解表达多种非融合的独立的目的蛋白。位于载体 3'端可

以非组织特异性地表达甲基鸟嘌呤甲基转移酶变异体（methylguanine

methyltransferase，MGMT）P140K 的耐药基因由人磷酸甘油酸激酶启动子（phosphoglycerate

kinase promoter，PGK-P）控制，这样可以通过使用化疗药物 BG 和BCNU 富集基因修饰的阳

性细胞，并确保在筛选富集细胞的过程中目的基因受到有效控制，不会表达。为提高载体制备

的有效性，增加慢病毒滴度和转染率，删除了慢病毒载体 LCR 区域中功能待定的 HS1 和有增

强子活性的 HS4，同时删除了 β- 珠蛋白中具内含子增强子活性的第2 个内含子（intervening

sequence 2，IVS2）。

由于 LCR 主要的功能是激活β-珠蛋白基因簇，限制珠蛋白基因仅在红系细胞中表达，确保受

调控基因在发育或分化过程中以一定的时序和模式正确表达，因而赋予该载体具有红系组织特

异性。

为快速测定慢病毒载体所携带的目的基因可否在靶细胞中表达，我们还构建了非组织特异性慢

病毒载体 RRL-sEF1α-L-ASNase-2A-mCherry，利用 2A 联体技术将L-ASNase 基因和 mCherry

报告基因置于短的延长因子1α（short elongation factor 1α，sEF1α；删除了第一内含子）启动子

控制下，在联体基因的 3'端增加了土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（woodchuck hepatitis virus

post-transcriptional regulatory element ），以提升mRNA 的polyA 加尾效率。

为验证2A 是否影响下游报告基因的正常表达，还构建了仅表达 2A-mCherry 的非组织特异性慢

病毒载体 RRL-sEF1α-2A-mCherry。应用不同的限制性内切酶及DNA 重组技术构建上述慢病毒

转移载体。

1.3 重组慢病毒包装

用三质粒系统瞬时转染HEK 293T 细胞制备重组慢病毒颗粒。当HEK 293T 细胞在 10 cm 细胞

培养皿中生长达 80%~90% 汇合时，弃含双抗（青霉素终浓度为50 U/mL ，链霉素终浓度为50

mg/mL）的完全DMEM 培养基（含10% FBS），将 PEI 转染三质粒混悬液（质粒总量为8

μg/皿，pMD2.G、psPAX2 和转移质粒按 123∶ ∶ 的质量比例混悬于1 mL 无血清无抗生素

DMEM 中，再加 24 μL pH7.0 的1 μg/μL PEI）加至用 9 mL 含10% FBS 的完全培养基覆盖的

HEK 293T 细胞中，24 h 后弃上清，换预热的新鲜完全培养基，分别于48 和96 h 收获细胞培养

上清中的病毒液，500 r/min 离心 10 min 除去脱落的细胞和大的细胞碎片，用 0.45 μm 的滤器过

滤上清，滤液经8500 r/min 离心 12 h 浓缩病毒颗粒，用无血清的 AIM-V XIVIVO-5 培养基重悬

病毒颗粒，分装至冻存管，-80℃保存备用。将重组慢病毒以载体名称命名。

1.4 重组慢病毒滴度测定

用终质量浓度为8 μg/mL 的Polybrene 介导重组病毒颗粒转染小鼠成纤维细胞 NIH/3T3，培养 7

d后用 InstaGene Matrix 抽提基因组 DNA。以稳定表达对照病毒 RRL-sEF1α-GFPLuc

的NIH/3T3 细胞基因组为对照，2 套引物-探针联合使用，采用多重 TaqMan PCR 检测病毒滴

度。慢病毒序列检测所用正向引物为 GAG-F（5'-GGAGCTAGAACGATTCGCAGTTA-3'），反

向引物为 GAG-R（5'-GGTTGTAGCTGTCCCAGTATTTGTC-3' ），探针为GAG-P（5'-

［FAM］ACAGCCTTCTGATGTTTCTAACAGGCCAGG［TAMRA］-3'）。小鼠 β-actin（简称

BAC ）为内源性对照，正向引物为 BAC-F（5'-GGCACCACACCTTCTACAATG-3'），反向引

物为 BAC-R（5'-GGGGTGTTGAAGGTCTAAAC-3' ），探针为BAC-P（5'-

［HEX］TGTGGCCCCTGAGGAGCACCC［BHQ1］- 3' ）。用 Applied Biosystems 公司的

7500 PCR 仪，每个定量PCR 反应中基因组 DNA 共使用 100 ng（1×TaqMan 快速 PCR 混合试

剂，500 nmol/L 基因特异性正、反向引物和探针），每组反应设3个重复。在 SDS 2.1 软件中

设置定量PCR 反应程序为95℃ 10 min 热启动；PCR 反应 94℃ 15 s，60℃ 1 min，40 个循环。

已知稳定表达对照病毒 RRL-sEF1α-GFPLuc 的NIH/3T3 每个细胞中有 1 个慢病毒载体拷贝数

（vector copy number，VCN ），其基因组 DNA 用未感染慢病毒的 NIH/3T3 细胞基因组 DNA

进行1/5 系列稀释后，通过定量PCR 获得慢病毒转染的VCN 回归曲线。根据该曲线，计算未

知样品中感染重组慢病毒 GAG 基因的拷贝数。病毒滴度（titer，T）计算公式：

T（U/mL）=VCN×稀释率的倒数×起始细胞数。

1.5 免疫染色

人宫颈癌 HeLa 细胞接种于 6孔培养板的无菌盖玻片上，非组织特异性重组慢病毒 RRL-sEF1α-

L-ASNase-2A-mCherry 按1 10 ∶ 稀释感染 HeLa 细胞，24 h 后换新鲜完全培养基，96 h 后用

PBS 洗3次，用 4%多聚甲醛固定30 min，PBS 洗后用含0.5%Triton X-100 的PBS 透化30

min，用 Image-iT FX 信号增强剂封闭30 min，加入 1 500∶稀释的兔抗大肠杆菌 L-ASNase 多抗

室温孵育2 h，PBS 洗后，加入 1 1000∶稀释的键合了 Alexa 488 的山羊抗兔IgG，室温避光孵

育60 min，PBS 洗后，晾干的盖玻片用抗褪色金牌介质在载玻片上装片，指甲油封片。

1.6 BG/BCNU 筛选与报告基因检测

为有效富集阳性转染细胞，MEL 细胞经重组慢病毒感染后，先与50 μmol/L BG 孵育1 h，再加

50μmol/L BCNU 于37℃共孵育1 h，1 h 后换预热的不含药物的新鲜培养基，以后每3 d 换1次

培养液，移除悬浮细胞，筛选 14 d 后进行后续实验。分别在指定时间收获 1×105 经筛选富集的

感染非组织特异性重组慢病毒的 MEL 细胞，用流式细胞仪检测 mCherry 红色荧光强度，以评

估BCNU 有效筛选情况。用荧光显微镜监测感染组织特异性重组慢病毒的 MEL 细胞分别在5

mmol/L HMBA 诱导前、后报告基因 mCherry 的表达情况，以评估调控因子对目的基因组织特

异性表达的控制效果。

同时用流式细胞仪监测感染或未感染重组慢病毒的 MEL 细胞经5 mmol/L HMBA 诱导前、后

报告基因 mCherry 的表达情况，以评估 MEL 细胞向红系终端分化过程中携带目的蛋白的能

力。

1.7 免疫印迹

在指定时间收获感染或未感染或诱导的 MEL 细胞，用哺乳动物细胞总蛋白抽提试剂抽提细胞

总蛋白，用 Bradford 法进行蛋白定量，取等量总蛋白（每孔60 μg/20 μL ）进行12% SDS-

PAGE，然后转移至 PVDF 膜，室温下用 50 g/L 脱脂奶粉封闭1 h，膜与 1 1000∶稀释的一抗于

4℃孵育过夜，洗膜后与 HRP 标记的二抗于 37℃温育1 h，ECL 显色，获取图像。检测 L-

ASNase 印迹膜使用的一抗为兔抗大肠杆菌 L-ASNase 多克隆抗体，二抗为山羊抗兔IgG ；检测

mCherry 的印迹膜使用的一抗为鼠抗mCherry 单克隆抗体，二抗为兔抗鼠IgG；检测看家基因

GAPDH 表达的印迹膜使用的一抗为鼠抗GAPDH 单克隆抗体，二抗为兔抗鼠IgG。

2 、结果

2.1 慢病毒转移载体的构建和鉴定

为增加慢病毒滴度和转染率，在不影响重组蛋白表达的组织特异性和预期可以维持目的基因需

要的表达水平的基础上，采用优化的基因调控因子，即选择较短的 β-珠蛋白启动子，并去除β-

珠蛋白 IVS2 和LCR 中的 HS1 和HS4，构建了结构正确的含目的基因及报告基因的红细胞组织

特异性的慢病毒载体 RS9- L- ASNase- 2A- mCherry- PGK- MGMT- HS4-IVS2（-）、非组织特

异性慢病毒载体 RRL-sEF1α-L-ASNase- 2A- mCherry 和RRL- sEF1α- 2A- mCherry（图1），并

经限制性酶谱鉴定和测序分析验证。

2.2 重组慢病毒滴度检测

重组慢病毒载体分别与包装质粒psPAX2 和包膜蛋白质粒pMD2.G 经PEI 介导瞬时共转染293T

细胞获得重组慢病毒，经8500 r/min 离心浓缩，用多重 TaqMan PCR 测得重组慢病毒 RS9-L-

ASNase-2A-mCherry- PGK- MGMT- HS4- IVS2（- ）的滴度为（4.21±0.58）×107U/mL，RRL-

sEF1α-L-ASNase-2A-mCherry 的滴度为（7.6±2.5）×106U/mL，RRL-sEF1α-2A-mCherry 的滴度

为（2.05±0.67）×107U/mL。

2.3 重组慢病毒 RRL- sEF1α- L- ASNase- 2A-mCherry 在HeLa 细胞中表达携带基因的检测

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摘要：

基因修饰红细胞输送左旋天门冬酰胺酶的体系构建左旋天门冬酰胺酶（L-asparaginase，L-ASNase）是治疗淋巴细胞白血病等恶性血液病的重要药物之一。某些类型的肿瘤细胞表达的L-天门冬酰胺合成酶（L-asparaginessynthetase，L-AS）活性远远低于正常细胞，难以在胞内将氨或L-Glu的酰胺基在ATP和Mg2+存在时有效地转移至L-Asp的β羧基生成L-Asn，因而迫使这类肿瘤细胞利用外源Asn以维持胞内蛋白质合成与细胞增殖；而L-ASNase可水解Asn（必需氨基酸）为Asp和氨，由于人体内不存在天然L-ASNase，若向患者体内引入L-ASNase，全身性降解Asn...

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