磷酸化组氨酸相关生物化学性质研究综述
磷酸化组氨酸相关生物化学性质研究综述
蛋白质磷酸化的相关研究起步于 20 世纪初．尽管 Levene 等[1] 早在 1906 年就发现卵黄素蛋白
中存在磷酸基团，但直到 1932 年他们[2]才鉴定出该磷酸基团是磷酸化的丝氨酸．此后，一系
列磷酸化氨基酸得到验证，包括 9 种天然氨基酸(丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、赖氨酸、精氨
酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和组氨酸) 与羟脯氨酸．磷酸化主要包含 4 种模式，即 O- 磷
酸化、N- 磷酸化、S- 磷酸化和酰基磷酸化．其中磷酸化丝氨酸、磷酸化苏氨酸与磷酸化酪氨
酸已被广泛研究( 图1)．它们在细胞代谢与调控中起到了重要的作用[3]．但是，其他一些磷酸
化氨基酸无论从含量或者功能上都不可忽视，磷酸化组氨酸就是一个重要代表.
磷酸化组氨酸是一种广泛存在的磷酸化氨基酸，据估计其在真核细胞内含量虽然不及磷酸化丝
氨酸，却是磷酸化酪氨酸的数十倍[4] ．而且 N—P 共价键的特异性导致磷酸化组氨酸有多种不
同于 O—P 共价键连接的磷酸化丝氨酸、磷酸化苏氨酸或磷酸化酪氨酸的化学性质．同时，蛋
白质中组氨酸残基的磷酸化也是一种调节细胞内蛋白质功能的重要方式[5]．本文将从磷酸化组
氨酸的发现与发展历史出发，总结其相关生物化学性质的研究，并进一步综述该修饰后氨基酸
生理功能的相关研究．
1发现历史
磷酸化组氨酸最早由 Severin 等[6]于1947 年实现化学合成．1963 年，Boyer 小组[7]才在线粒体
蛋白质的研究中完成其生化检验．人们最初认识到磷酸化组氨酸可能是一个磷酸化酶的中间体
状态，而该步骤是某些酶催化过程所必需的．随着研究的深入，人们逐渐发现磷酸化组氨酸是
一种广泛存在于生物界的信号调节方式[8]．1994 年，Simon 等[9]报道了原核生物细菌中基于
“ ”组氨酸磷酸化酶的 双组分 信号传递系统；1993 年，报道了酵母[10]中的同源序列蛋白质
SLN1 与SSK1[11]．2000 年，Muimo 研究组[12]发现，绵羊气管上皮细胞体系中钙离子依赖性
磷酸结合蛋白 annexinⅠ 存在组氨酸磷酸化现象．γ-32P 标记的 ATP 和GTP 及相关磷酸化氨基
酸生化分析证明了这一结论．这一磷酸化过程进一步导致 annexinⅠ 下游的信号传递．因而，这
个工作证明了组氨酸磷酸化在哺乳动物细胞信号传递过程中的重要作用．另一方面，人们也在
探索磷酸化过程的逆过程，即去磷酸化过程．在细菌中，很多磷酸化酶本身也具有去磷酸化作
用．Mizuno 小组[13]报道了第一个大肠杆菌中的磷酸化组氨酸去磷酸化酶 SixA ．该酶是 ArcB
信号通路的一个重要调节因子．此后，人们在哺乳动物细胞中也发现了许多磷酸化组氨酸去磷
酸化酶[14]，而且它们具有各自不同的功能[15]．另外，其他一些氨基酸残基的激酶也被报道
利用磷酸化组氨酸作为中间体[16]．这些信号通路与某些人体生理及病理状态直接相关，例如
组蛋白上组氨酸的磷酸化与基因转录与表达直接相关[17],这些去磷酸化酶也因而成为潜在的药
物靶点[18]
2化学结构与命名法
人们对磷酸化组氨酸结构的研究持续了很长时间．磷酸化组氨酸在生物体内存在两种异构体，
二者的差别在于咪唑环上磷酸化的位点不同( 图2)．这一特性与其他所有的磷酸化氨基酸都有
区别．另外，人们还化学合成了 1, 3- 二磷酸化组氨酸，但是其并没有在生物体系中被发现
[19]。
值得注意的是，对于磷酸化组氨酸两种异构体的命名一直都存在分歧．长久以来，大部分对于
磷酸化组氨酸报道的文献中都将异构体3 称为 3- 磷酸组氨酸[20]．然而，基于对于咪唑环的传
统编号命名法，也有文献[21]将异构体3 称为 1- 磷酸组氨酸．除此之外，Delbaere 等[22]在蛋
白质晶体学的研究报道中还将2和3 两个异构体分别称作Nδ1 位磷酸化和 Nε2 位磷酸化的组氨
酸．为了避免类似的命名差异，国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)以及国际生化联合会(IUB)
联合发表了关于含有磷酸基团的众多生物分子的推荐命名法，其中便包含了这一对异构体
[23]．在该命名法中，异构体2被称为 3(1)- 磷酸组氨酸，而异构体3 被称 为 1 (3)- 磷酸组氨
“酸，同时，词 头 由phosphor” “改为 phosphono”以表示离子状态．此外，该命名法还推荐将
异构体2称为 π-磷酸组氨酸或 pros-磷酸组氨酸，而异构体3称为 τ-磷酸组氨酸或 tele-磷酸组氨
酸．
3主要生物化学性质
3.1 化学不稳定性
由于磷酸化组氨酸本身的化学不稳定性，其在生物体内研究的报道相对于其他磷酸化氨基酸的
报道一直较少．从热力学角度看，磷酸化组氨酸中磷酸基团与咪唑环上的 N 原子连接形成磷酰
胺结构．磷酰胺键本身是不够稳定的，这是由于磷酰胺结构中的 P—N 化学键水解过程的自由
能变化(水解过程的标准吉布斯自由能变约为-12～-14 kcal/mol)较磷酸酯结构(磷酸化丝氨酸、
磷酸化苏氨酸、磷酸化酪氨酸) 中的 P—O 化学键水解过程(水解过程的标准吉布斯自由能变约
为-6.5～-9.5 kcal/mol)的自由能变化大了不少[24]．从动力学的角度看，磷酸化组氨酸对酸较为
敏感，而其他通过磷酸酯连接的磷酸化氨基酸对酸较为稳定[25]．实验表明，1 mol/L 盐酸溶液
在100℃ 条件下，游离的磷酸化丝氨酸、磷酸化苏氨酸的半衰期约为 18 h，而磷酸化酪氨酸约
为5 h．1 mol/L 盐酸溶液在49℃条件下，游离的磷酸化组氨酸半衰期也只有数十秒．尽管两种
磷酸化组氨酸的异构体都很容易在酸性溶液中发生去磷酸化，二者的热力学稳定性是有所区别
的．π-磷酸组氨酸相比于τ- 磷酸组氨酸不稳定，因此水解也就更快．而 π- 磷酸组氨酸和 τ- 磷
酸组氨酸的稳定性差异被认为是N 原子上磷酸基团与质子化的 α-氨基的空间距离不同所致
[26]．
3.2 含有磷酸化组氨酸蛋白的制备及异构体的形成与转化
为了研究磷酸化组氨酸在蛋白质调控中的作用，我们需要首先制备含有磷酸化组氨酸的蛋白，
同时也可以将此作为正对照组．方法一，最直接的方法是磷酸激酶磷酸化法．通过酶法进行磷
酸化可以实现在组氨酸特定位点的选择性磷酸化，但是只对特定酶识别的底物有效．例如酶法
制备的组蛋白 H4 已经被广泛地应用在生化实验中[27]．方法二，选择性的化学磷酸化也是一
种常用的方法[28] ，即利用磷酰胺钾盐在pH 7～8 的条件下处理蛋白质，便可以高产率地实现
组氨酸磷酸化，其他各类氨基酸残基并不会被磷酸化．需要注意的是，在此反应中，π-磷酸组
氨酸是动力学优势的产物．而随着反应的进行，热力学较为稳定的 τ-磷酸组氨酸会逐渐成为优
势产物．虽然通过色谱可以将两种异构体分离，但是通过化学方法得到纯净的π-磷酸组氨酸还
是一个挑战．最近，K inig �小组[29]报道了利用磷酰胺基钾(PPA)作为磷酸化试剂直接修饰天
然蛋白质的工作．对于含有多个组氨酸残基的模型蛋白，该处理法将得到一系列不同数目的组
氨酸磷酸化产物．他们利用生化手段进行了表征．PPA 对所有测试的蛋白质都适用，而且还能
保证其三级结构的完整性．另外，π-磷酸组氨酸即便在温和的碱性溶液中也缓慢地转化为τ-磷
酸组氨酸[26]，这一情况同样可能发生在分离与鉴定过程中，因而我们可以猜想从生物体内提
取分离的 τ-磷酸组氨酸可能有一部分由 π-磷酸组氨酸转化而来．
4磷酸化组氨酸及其相关蛋白质的研究方法
由于磷酸化组氨酸具有酸不稳定性，因此传统的鉴定分离方法不太实用．相反，磷酸化组氨酸
具有碱稳定性，即便在强碱的热溶液中也不降解．而这样的条件可以将磷酸化丝氨酸和磷酸化
苏氨酸等分解．这归因于磷酰胺与磷酸酯化学性质的差别．
4.1 生化技术与分析化学技术
用非特异性蛋白酶处理磷酸化蛋白可以将其降解为相应多肽片段．可以用反相薄层层析法(RP-
TLC)进行鉴定，用反相电泳、反相高效液相色谱(RP-HPLC)等进行分离．质谱或者串联质谱
(MS/MS)也已广泛用于磷酸化蛋白的分析[28]．需要特别注意的是，液相色谱的流动相如果含
有酸性成分可能使其分解，而且质谱分析中的正离子检测模式也可能使得磷酸化组氨酸脱去磷
酸基团．为了克服这一技术挑战，人们做了很多相关探索．Ross 小组[30] 以已知的磷酸化蛋白
HPr 为例，对样品制备、亲和分离及质谱技术进行了系统性研究．近期又有一些新的技术进展
[31]．另外，由于自然条件下丰度最高的同位素31P 具有很强的核磁共振信号，因而核磁共振
磷谱(31P NMR)长期被用作一种磷酸化蛋白质的分析手段[32] ．自从 Gassner 等[33] 于1977 年报
道了首个τ-磷酸组氨酸与 π-磷酸组氨酸 1H 与31P NMR 的精细数据以来，人们已经将这一研究
手段拓展到鉴定蛋白质中的磷酸化组氨酸异构体的研究中[34]．同时，人们也发展了相应的生
化技术来研究直接提取含有磷酸化组氨酸的蛋白质．由于磷酸化蛋白质在体内的含量很低，首
先需要对其进行富集．磷酸化蛋白质组学为此提供了具体的研究方法并取得了重要的突破
[35]，人们考虑借鉴其他磷酸化氨基酸的类似研究思路用免疫亲和色谱或者固定金属亲和色谱
(IMAC) 进行研究．例如 Napper 与其合作者[36]通过固定的铜离子(Ⅱ)亲和色谱富集分离了含磷
酸化组氨酸的多肽，并用 MALDI-TOF 质谱进行了研究．此外，人们还发展了带有荧光基团或
者生物素标记的分子工具用于相关研究．最近，Carlson 等[37] 设计并合成了荧光基团 -ATP 类
似物相连的分子(BODIPY-FL-ATPγS)．由于其可以与组氨酸激酶(HK) 的ATP 结合位点相结
合，因而可以被作为一种新型策略用于二组分系统的功能研究或者抑制剂筛选．Boon 小组[38]
还设计并合成了 ATP-γ-Biotin-LC-PEO- 胺分子，他们发现该分子可以作为一种生物素标记的激
酶底物．该分子工具可以用于对包括组氨酸磷酸化激酶或含磷酸化组氨酸蛋白的蛋白质磷酸化
研究．4.2 磷酸化组氨酸类似物。
基于磷酸化组氨酸本身的不稳定性，人们考虑设计合成一些类似物进行模拟．方法一， Lasker
等[39]的研究表明，含有硫代磷酸化组氨酸(tpHis) 的多肽甚至在pH 为0 的溶液里 3 h 都保持稳
定．这正是由于硫原子的电负性与吸电子能力相对于氧原子都要低一些，该类似物的酸性水解
稳定性得到提高．tpHis( 图3, 4)可以很容易地从组氨酸化学合成得到；利用组氨酸激酶可以直
接将 ATPγS 选择性连接到组氨酸残基上[40]，这一酶法的制备策略早已在其他磷酸化氨基酸的
类似物合成中使用过[41]．方法二，将易水解的磷酰胺键直接转化为难以分解的C—P 共价键
也是一种很自然的类似物设计法，而且也被多次用于其他磷酸化氨基酸类似物的设计中[42]．
首先，人们发展了将二唑环改造为其他杂环类似物的策略，例如呋喃环( 图3, 5)[21]、吡咯环
( 图3, 6)[43]和三唑环[44]( 图3, 7, 8)；其次，人们还设计磷酸基团本身的类似物以实现将易水解
的P—N 键替代为C—N 键的目的，例如丙二酸酯衍生物[45]( 图3, 9～12)．此外，Hedberg 等
[46] 报道了以C—S 共价键进一步替换 C—P 共价键得到的类似物( 图3, 13) ．他们将其用于
Fmoc- 固相合成中，并用合成的多肽作抑制剂对组氨酸去磷酸化酶进行结合蛋白捕获(pull-
down)实验．特别是，这种磺酰胺类似物的氨基被认为可以模拟磷酸基团水解的过渡态．同样
利用铜离子催化的 Click 反应，Brimble 等[47]还发展了一种新型的三唑丙氨酸模拟物( 图3,
14)，并将其用于多肽合成．
摘要：
展开>>
收起<<
磷酸化组氨酸相关生物化学性质研究综述蛋白质磷酸化的相关研究起步于20世纪初．尽管Levene等[1]早在1906年就发现卵黄素蛋白中存在磷酸基团，但直到1932年他们[2]才鉴定出该磷酸基团是磷酸化的丝氨酸．此后，一系列磷酸化氨基酸得到验证，包括9种天然氨基酸(丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和组氨酸)与羟脯氨酸．磷酸化主要包含4种模式，即O-磷酸化、N-磷酸化、S-磷酸化和酰基磷酸化．其中磷酸化丝氨酸、磷酸化苏氨酸与磷酸化酪氨酸已被广泛研究(图1)．它们在细胞代谢与调控中起到了重要的作用[3]．但是，其他一些磷酸化氨基酸无论从含量或者功能上都不可忽视，磷酸化...
相关推荐
-
中华人民共和国气象法
2024-12-30 57 -
中国气象局关于修改《气象行政许可实施办法》的决定
2024-12-30 53 -
中国气象局关于修改《气象行政处罚办法》的决定
2024-12-30 97 -
中国气象局关于修改《防雷减灾管理办法》的决定
2024-12-30 163 -
中国气象局关于废止部分部门规章的决定
2024-12-30 45 -
通用航空飞行管制条例
2024-12-30 78 -
施放气球管理办法
2024-12-30 115 -
人工影响天气管理条例
2024-12-30 48 -
气象资料共享管理办法
2024-12-30 45 -
气象专用技术装备使用许可管理办法
2024-12-30 70
作者：闻远设计
分类：社科文学类资料
价格：免费
属性：8 页
大小：222.02KB
格式：DOCX
时间：2024-04-20
