间充质干细胞的分离及其类髓核细胞分化导向

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来源：学术堂作者：周老师

发布于：2014-06-10 共8662 字

间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSCs）是来源于中胚层的未分化的发育早期细胞，具有

较强的增殖能力和多向分化能力。在特定的内环境和一定的细胞因子的诱导作用下，其可定向

分化为多种组织细胞，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、肝细胞、神经细胞、成

纤维细胞等，正是由于其所具有的特性，使其成为了组织工程学中最常用的种子细胞。

由于骨髓间充质干细胞（bonemarrow mesenchymalstemcells, BMSCs）具有取材方便、体外培养

简单、繁殖能力强、供体创伤小、不涉及伦理问题、良好的组织相容性、及其低抗原性所表现

出的低免疫反应性等优点，使其成为了组织工程中经常使用的间充质干细胞。国内外均有使用

一定的细胞因子诱导 BMSCs 增殖和分化为类软骨细胞及类髓核细胞的相关报道。本实验抽取

新西兰兔的骨髓细胞，利用全骨髓贴壁法分离间充质干细胞，经过传代培养后再通过中胚层定

向诱导分化的方法对所获取的细胞进行鉴定，确定其定向分化能力，再以转化生长因子

3（Transforming Growth Factor- 3,TGF- ）和骨形态发生蛋白 7（Bone Morphogenetic Protein -

7,BMP-7）生长因子诱导其向类髓核细胞分化，为组织工程髓核的构建提供良好的种子细胞选

择。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

DMEM-LG 培养基（Gibcol）、胎牛血清（Gibcol）、DMEM-HG 培养基（Gibcol）、成骨诱

导培养基（地塞米松 10-9M ，抗坏血酸钠 0.2mM，- 甘油磷酸钠 10mM，5%FBS，DMEM-LG

培养基，1% 双抗溶液）、成软骨诱导培养基（地塞米松 10-7M，抗坏血酸钠 0.2mM，丙酮酸

钠1mM，转化生长因子- 110ng/ml，ITS+LA，DMEM-HG 培养基，2%FBS，1%双抗溶液）、

成脂肪诱导培养基（地塞米松 10-7M ，吲哚美辛 0.05mM，IBMX0.5mM，2%FBS，DMEM-HG

培养基，1% 双抗溶液）、茜素红 S（Roche Ⅱ）、羊抗牛型胶原多克隆抗体（Southern

Biotechno-logy ）、番红 O（Sigma ）、油红 O（Sigma）、TGF- 3（sigma）、BMP-

7（sigma），CD29、CD105、CD166 均购自 eBioScience。新西兰兔购自上海生旺实验动物养

殖有限公司。

1.2 兔BMSCs 的分离培养

取2月龄的新西兰大白兔，雌雄不限，戊巴比妥溶液腹腔麻醉后，常规备皮，消毒，严格无菌

操作，以骨髓穿刺针接 10ml 注射器（注射器内含稀释的肝素钠 3000U/0.2ml）自胫骨近端内侧

处行骨髓穿刺术，抽取骨髓液 3ml，缓慢注入预置 4ml 淋巴细胞分层液的离心管内，进行密度

梯度离心。2000rpm 离心 20 分钟后，吸取中间的单个核细胞层，弃去上清和脂

肪，PBS（Phosphate Buffered Saline, 磷酸盐缓冲液）缓冲液冲洗 2 次，再以 1.6×104/cm2 的浓

度接种于 100mm 培养皿内，加入 15ml Ham’s F12 培养液（含青霉素钠 100U/ml ，链霉素

100g/ml，两性霉素B 0.25 g/ml) ，加入胎牛血清终浓度为10%，置37℃、5%CO2、饱和湿度的

条件下培养，于 48 小时后换液，以 PBS 冲洗 3 遍，去除全部非贴壁细胞，换上新鲜培养基，

同样环境中继续培养。以后每3 日换液一次，待原代培养细胞爬满培养瓶底时，即可进行传

代。用 0.25% 的胰蛋白酶消化 5 分钟后，即可得兔原代骨髓间充质干细胞悬液。

1.3 兔BMSCs 表面抗原的鉴定

取生长汇合约 90% 的第3 代细胞，小心吸去培养液，加入 3ml0.25%胰蛋白酶/EDTA 消化液，

于37℃ 消化约3 分钟，加入含10%FBS 的DMEM 培养液 1ml 中止消化，PBS 冲洗两次，以

1000rpm 离心 5 分钟，弃去上清，加入新鲜培养液制备成细胞悬液，并调整细胞浓度为

1×106/ml ，取 100 l 细胞悬液置于流式管中，按照试剂说明加入抗体，充分混匀后室温避光放

置30 分钟，加入流式细胞仪缓冲液1ml 混匀后1000rpm 离心 5 分钟，弃去上清，再加入 0.5ml

流式细胞仪缓冲液重悬细胞后，以流式细胞仪进行检测。

1.4 兔BMSCs 的诱导分化

1.4.1 向成骨细胞方向诱导分化

取基本铺满瓶底的第3代细胞，胰蛋白酶消化后以 2×104/cm2 的密度接种于 24 孔板中，加入

成骨诱导培养液，每3 天换液一次，培养 14 天后行茜素红 S 染色。

1.4.2 向成软骨细胞方向诱导分化

取基本铺满瓶底的第3代细胞，胰蛋白酶消化后洗涤，以 2×106/ml 加入 15ml 离心管中以

500rpm 离心 5 分钟，获得细胞团块后置入成软骨诱导培养基中悬浮培养，每3 天换液1次，

培养 14 Ⅱ 天后行型胶原染色和番红 O 染色。

1.4.3 向脂肪细胞方向诱导分化

取第3代细胞，胰蛋白酶消化后以 2×104/cm2 的密度接种于 24 孔板中，加入成脂肪诱导培养

液，每3天换液一次，培养 14 天后行油红 O 染色。

1.5 BMSCs 的诱导分化

根据不同的诱导条件，将获得的BMSCs 分为四组：A 空白对照组；B200ng/mLBMP-7 单独诱

导组；C15ng/mlTGF- 3 单独诱导组；D TGF- 3 和BMP-7 联合诱导组。将四组细胞在

37°C、5%CO2 孵育箱中培养 24 小时后更换新鲜培养液，此后每2 天换液1 次，连续培养 21

天后收集细胞，用 Trizol 试剂消化裂解，提取细胞中的 mRNA 。再用 First Strand

cDNASynthesis Kit 将提取的 mRNA 逆转录为cDNA 。以 cDNA 为模板，进行 Realtime PCR 检

Ⅰ Ⅱ Ⅹ 测蛋白聚糖、型胶原、型胶原、型胶原和 SOX9 基因的表达水平。

1.6 统计学处理

采用SPSS13.0 统计软件对所得数据进行统计学分析。先行组间的单因素方差分析

（ANOVA），再以 Bonferroni 法行两两之间的多重比较，<0.05 为有统计学意义。

2 结果

2.1 兔BMSCs 培养结果

在光学显微镜下，原代细胞接种后，细胞多呈现圆球形，大小不均一，呈散在分布，悬浮于培

养液中，培养 8~10 小时后即可见有体积较大单核细胞逐渐沉降贴壁（图1-A），48 小时后，

少量细胞已经贴壁，形态呈圆形或多角形，贴壁的细胞大小不等，形态不一，培养 4 天后大部

分细胞呈梭形，部分细胞处于分裂期，细胞数量较开始时明显增多（图1-B）。大约2 周细胞

已基本融合，细胞之间相互重叠，细胞排列紧密，细胞大小、形态较为均一。传代细胞在培养

瓶中均匀分布后呈贴壁生长，细胞间形态较为一致，呈纺锤形外观（图1-C，图1-D ）。（图

1 ）

2.2 兔BMSCs 表面抗原鉴定结果

采用流式细胞计数对第3 代细胞进行检测，结果显示细胞均一性可达90%以上，表面标记物检

测结果如下图（图2 ）。

由结果可知，分离所得的细胞表面可以稳定表达CD29、CD105 和CD166 三种骨髓间充质干细

胞最为特异性的表面标记物，其中 CD29 表达率为（71.4±3.3）%，CD105 表达率为

（49.3±2.1）%，CD166 表达率为（88.7±2.7）%。因此可以说明，前期工作中分离培养所获得

的细胞即为骨髓间充质干细胞。

2.3 兔BMSCs 中胚层诱导分化结果

2.3.1 兔BMSCs 向成骨细胞诱导分化结果

在成骨诱导培养液的诱导分化下，细胞形态在 8 天左右发生不规则改变，呈长梭形、多角形，

部分细胞呈卵圆形。诱导 14 天时卵圆形细胞明显增多，融合紧密。于诱导 14 天时对细胞行茜

素红 S 染色显示：细胞外基质中有明显的钙结节形成。由此可以说明，分离培养的细胞在成骨

诱导培养液作用下可向成骨细胞方向分化。（图3 ）

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间充质干细胞的分离及其类髓核细胞分化导向来源：学术堂作者：周老师发布于：2014-06-10共8662字间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSCs）是来源于中胚层的未分化的发育早期细胞，具有较强的增殖能力和多向分化能力。在特定的内环境和一定的细胞因子的诱导作用下，其可定向分化为多种组织细胞，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、肝细胞、神经细胞、成纤维细胞等，正是由于其所具有的特性，使其成为了组织工程学中最常用的种子细胞。由于骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs）具有取材方便、体外培养简单、繁殖能力强、供体创伤小、...

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