光诱导表达系统在昆虫细胞中的功能探讨
光诱导表达系统在昆虫细胞中的功能探讨
来源：动物医学进展 作者：韩增鹏,蔡泽蕲,阮士龙
发布于：2021-04-09 共7732 字
摘 要： 光诱导技术是一种新兴的基因表达调控技术,目前已应用于原核细胞、哺乳动
物和鱼类细胞。为探索光诱导技术在昆虫细胞基因表达系统中的调控功能,采用具有代表性的
C120-EL222 光诱导系统,在昆虫细胞表达质粒 pMIB/V5-His 的基础上,构建了集光诱导外源基因
表达框与光激活转录因子于一体的昆虫细胞光诱导表达载体 pMIB-C120-GOI-GFP-EL222 质
粒。将上述质粒转染昆虫 Sf9 细胞,通过检测光诱导产生的红色荧光蛋白(mCherry)或海参荧光素
酶(hRluc)报告基因的表达,对光诱导元件的功能进行了定性和定量分析。结果表明,C120-EL222
光诱导系统在昆虫 Sf9 细胞中具有较高的效能和严谨性,为光诱导表达技术在昆虫细胞基因表达
调控中的深入研究和应用奠定了基础。
关键词： 光诱导技术; 昆虫细胞系; 基因表达调控; 报告基因;
Abstract： Light-induction is a new technique of gene expression regulation.However,its
application is limited to prokaryotic cells and mammalian and fish cells.In order to explore the
functional effectiveness of light induction technology in insect cell lines,a representative C120-EL222
light induction system was adopted in this study.On the basis of insect cell expression plasmid
pMIB/V5-His,the pMIB-C120-GOI-GFP-EL222 plasmid,which integrates the expression frame of
exogenous gene induced by light and the transcription factor activated by light,was constructed.The
above plasmids were transfected into insect Sf9 cells,and the expression of the light-induced red
fluorescent protein(mCherry) or humanized Renilla luciferase(hRluc) reporter gene was detected after
light induction,and the function of the light-induced elements was detected qualitatively and
quantitatively.The experimental results showed that the C120-EL222 light induction system had high
efficiency and preciseness in insect Sf9 cells.This study expands the application scope of the light-
induced expression technology and lays a foundation for further research and application of the light-
induced expression technology in insect cells.
Keyword： Light-induction technology; insect cell; gene expression regulation; reporter gene;
昆虫细胞表达系统因其表达重组蛋白效率高、生产成本低、蛋白翻译后修饰等优点[1],被广泛
应用于功能性重组蛋白、人或兽用疫苗以及基因治疗用重组腺相关病毒载体(rAAV)等的生产
[2,3],如β干扰素、人乳头瘤病毒疫苗的抗原 L1 蛋白、猪圆环病毒 2型疫苗的抗原 Cap 蛋白及 1
型rAAV 载体药物 Glybera 等[4,5,6]。昆虫细胞表达系统主要有两种类型,一种是在昆虫杆状病
毒感染的情况下,利用昆虫杆状病毒晚期基因强启动子(如P10、PH 等)实现外源基因大量表达,
最常用有 Bac-to-Bac 系统[7];另一种是在没有杆状病毒感染的情况下,利用昆虫细胞建立的稳定
细胞系,通过昆虫细胞特异性启动子(如OpIE1、OpIE2 等)实现外源基因的大量表达[8]。利用昆
虫细胞表达特殊蛋白复合体或具有细胞毒性蛋白时,常规表达调控方法并不适合。因此,需要在
时间、空间和表达强度方面具有更灵活精确的基因表达调控方法。过去 20 多年来,四环素诱导
表达系统、甲醇诱导表达系统等依赖小分子化合物调控的系统,常用于时间维度的基因表达调控
[9]。组织细胞特异性启动子常用于特定空间尺度的基因表达控制,但严谨性通常不高。
光诱导转录调控技术可用于基因表达的空间和时间双重精准控制[10,11]。当前的光诱导表达系
统仍存在一些缺点限制着它的应用,例如蛋白本身的毒性、调控范围有限以及激活和去激活作用
迟缓。2014 年,Motta-Mena 等建立了 C120-EL222 光诱导转录调控系统[12]。其原理是在蓝光(波
长450nm 左右)照射下,含有工程化改造的光-氧-电压(Light-Oxygen-Voltage,LOV)蛋白亚基的光
诱导转录因子(EL222)发生二聚化,结合到相应的 DNA 序列 C120 调节元件上,启动目的基因的转
录与表达;在无光照条件下,这些结构变化能够自动逆转,使EL222 脱离结合的 DNA 启动子序列,
从而关闭基因的表达[13](图1A)。在哺乳动物 HEK293 细胞中,C120-EL222 光诱导表达系统可
以产生 200 倍以上的基因表达上调,具有快速活化(<10 s)和失活动力学(<50 s)。研究表明该系统
在斑马鱼中也具有功能,但是 EL222 蛋白对斑马鱼胚胎发育具有一定的毒性[12]。
目前还没有光诱导表达技术在昆虫细胞中应用的报道。本研究在昆虫细胞中对具有代表性的
C120-EL222 光诱导元件进行基因表达调控功能检测,首次证实了 C120-EL222 光诱导表达系统
在昆虫细胞中具有功能,进一步扩展了该光诱导表达系统的适用范围。
1 、材料与方法
1.1 、材料
1.1.1 、主要试剂
限制性内切酶、T4 DNA 连接酶,NEB 公司产品;Cellfectin Ⅱ Reagent 转染试剂,Invitrogen 公司产
品;Grace 昆虫细胞培养基、胎牛血清(FBS),GIBCO 公司产品;Gel Extraction kit 胶回收试剂
盒、Plasmid mini kit 质粒提取试剂盒,OMEGA 公司产品;Renilla Luciferase Assay System 荧光素
酶试剂盒,Promega 公司产品。
1.1.2 、主要仪器
PCR 热循环仪(K960),力康(Heal Force)生物医疗科技控股有限公司产品;恒温培养箱(ZXJD-
A1270)上海智城公司产品;多功能酶标仪(EnSpire),珀金埃尔默(PerkinElmer)公司产品;倒置荧光
显微镜(IX71),奥林巴斯(Olympus)公司产品。
1.1.3 、 载体与合成基因
质粒 pC120-Luc 和pVP-EL222 由Kevin H.Gardner 教授馈赠,质粒 pMIB/V5-His 购自 Invitrogen
公司。引物序列见表1。
表1 引物序列表
1.2 、方法
1.2.1 、 载体构建
首先,用引物E-mch-F 和X-mch-R 扩增mCherry 基因,插入到pC120-Luc 质粒的 EcoRⅠ 和XbaⅠ 酶
切位点之间,得到 pC120-mCherry 质粒。再用引物BspH-C120-F 和Age-Mch-R 扩增C120-
mCherry 片段,插入pMIB/V5-his 载体的 BspHⅠ 和AgeⅠ 酶切位点之间,得到 pMIB-C120-mCherry
质粒。然后,在携带有合成基因片段 PFT2AN 的质粒 pSimple-T/PFT2AN 中的 NheⅠ 酶切位点和
BsiwⅠ 酶切位点,分别引入由引物Nhe-GFP-F 和GFP-Nhe-R 扩增的 GFP 基因和由引物Bsiw-EL-F
和EL-Bsiw-R 扩增的 EL222 基因,得到 psimple-T/ GFP-EL222 质粒。再将GFP-EL222 片段插入
到pMIB-C120-mCherry 质粒的 PvuⅡ 和BglⅡ 酶切位点之间,得到 pMIB-C120-mCherry-GFP-
EL222 质粒,利用 SpeⅠ 和AgeⅠ 酶切位点将其 mCherry 基因置换成由引物Spe-hRluc-F 和Age-
hRluc-R 扩增的 hRluc 基因,得到 pMIB-C120-hRluc-GFP-EL222 质粒。最后,用BsiwⅠ 酶切去除上
述质粒中的 EL222 基因,得到功能缺失的对照质粒 pMIB-C120-mCherry-GFP 和pMIB-C120-
hRluc-GFP。
1.2.2 、 昆虫 Sf9 细胞培养与质粒转染
昆虫 Sf9 细胞来源于草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢细胞系,采用含有100 mL/L FBS 的
Grace 完全培养基贴壁培养在10 cm 培养皿中,培养温度28℃。转染前将 Sf9 细胞按每孔 8×105
个细胞的密度接种于 6孔板中,当细胞汇合度达到70%～80%时,用Cellfectin Ⅱ 转染试剂进行质
粒转染。转染 24 h 后,给予蓝光照射诱导并观察细胞状态。
1.2.3 、 昆虫 Sf9 细胞的光照射诱导与报告基因检测
摘要：
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光诱导表达系统在昆虫细胞中的功能探讨来源：动物医学进展作者：韩增鹏,蔡泽蕲,阮士龙发布于：2021-04-09共7732字 摘 要：光诱导技术是一种新兴的基因表达调控技术,目前已应用于原核细胞、哺乳动物和鱼类细胞。为探索光诱导技术在昆虫细胞基因表达系统中的调控功能,采用具有代表性的C120-EL222光诱导系统,在昆虫细胞表达质粒pMIB/V5-His的基础上,构建了集光诱导外源基因表达框与光激活转录因子于一体的昆虫细胞光诱导表达载体pMIB-C120-GOI-GFP-EL222质粒。将上述质粒转染昆虫Sf9细胞,通过检测光诱导产生的红色荧光蛋白(mCherry)或海参荧光素酶(hR...
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