骨髓间充质干细胞增殖分化中氯化锂的功能探究

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骨髓间充质干细胞增殖分化中氯化锂的功能探

究

来源：中国组织工程研究作者：付殷;孙贵才;涂远青;

发布于：2019-07-15 共8083 字

摘 要：背景:寻找促进骨髓间充质干细胞增殖及向成骨细胞分化的方法, 可以为治疗骨质疏

松类疾病提供治疗思路。目的:探讨氯化锂调控大鼠骨髓间充质干细胞增殖分化的机制。方法:

实验采用全骨髓细胞接种法和贴壁纯化培养大鼠骨髓间充质干细胞, 分别给予 0, 2, 5 nmol/L 氯

化锂进行干预;采用 CCK-8 法检测大鼠骨髓间充质干细胞的增殖情况, 茜素红染色法检测钙化结

节形成情况, PNPP 法测定碱性磷酸酶活性, Western blot 法检测大鼠骨髓间充质干细胞中

GSK3β, p-GSK3β, β-catenin 蛋白含量变化。结果与结论: 2, 5 nmol/L①氯化锂均能促进大鼠骨髓

间充质干细胞增殖, 5 nmol/L 氯化锂促增殖能力最强; 2, 5 nmol/L②氯化锂组矿化结节与碱性磷

酸酶活性均比 0 nmol/L 氯化锂组明显, 且5 nmol/L 氯化锂促成骨分化更为显着; 2, 5 nmol/L③氯

化锂能够显着增加 p-GSK3β、β-catenin 蛋白表达, 而各组 GSK3β 蛋白表达差异无显着性意义;④

结果表明, 氯化锂能够促进大鼠骨髓间充质干细胞的增殖及向成骨细胞分化, 其可能机制是通过

调控 Wnt/β-catenin 信号通路相关蛋白表达实现的。

  关键词：氯化锂; 骨髓间充质干细胞; 细胞增殖; 成骨分化; 钙化结节; 碱性磷酸酶活性;

Wnt/β-catenin 信号通路; 国家自然科学基金;

  Abstract： BACKGROUND: Seeking proper methods to promote the proliferation and

osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells can provide therapeutic ideas for

the treatment of osteoporosis.OBJECTIVE: To study the mechanism of lithium chloride on the

proliferation and differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells.METHODS: Rat bone

marrow mesenchymal stem cells were cultured with the whole bone marrow cell inoculation and

adherent purification, followed by intervention with 0, 2, 5 nmol/L lithium chloride. Cell counting kit-

8 was used to detect the effect of lithium chloride on the proliferation of bone marrow mesenchymal

stem cells. Alizarin red staining was used to determine calcified nodules.PNPP method was applied to

measure alkaline phosphatase activity. The contents of glycogen synthase kinase 3β, phosphorylated

glycogen synthase kinase 3β and β-catenin in rat bone marrow mesenchymal stem cells were

determined by western blot.RESULTS AND CONCLUSION: Lithium chloride, 2 and 5 nmol/L,

promoted the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells and5 nmol/L lithium chloride had

the strongest proliferative effect. Compared with 0 nmol/L group, more calcified nodules and higher

alkaline phosphatase activity were observed in the 2 and 5 nmol/L groups, especially in the 5 nmol/L

group. Both 2 and 5 nmol/L lithium chloride upregulated the expression of phosphorylated glycogen

synthase kinase 3β and β-catenin proteins, but showed no difference in the expression of glycogen

synthase kinase 3β. In conclusion, lithium chloride can promote the proliferation and osteogenic

differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells, and the possible mechanism is through the

regulation of Wnt/β-catenin signaling pathway-related protein expression.

Keyword： lithium chloride; bone marrow mesenchymal stem cells; cell proliferation; osteogenic

differentiation; calcified nodules; alkaline phosphatase activity; Wnt/β-catenin signaling pathway;

National Natural Science Foundation of China;

 0、引言 Introduction

骨髓间充质干细胞具有自我更新、增殖潜能和分化成多种细胞类型的能力, 包括成骨细胞、脂

肪细胞、软骨细胞、神经元等[1,2,3]。骨髓间充质干细胞向脂肪细胞和成骨细胞的分化是竞争

性调节的[4,5], 在骨微环境平衡中起着关键的作用。在正常条件下, 骨髓间充质干细胞成脂分化

和成骨分化之间的平衡趋向成骨分化, 维持正常骨形成[6,7,8];但是在非正常情况下, 如骨质疏松

患者骨髓间充质干细胞分化的平衡可能被破坏, 骨髓间充质干细胞具有较低的生长速度, 并表现

出以减少成骨为代价的脂肪细胞分化, 导致低骨量和高骨髓脂肪量[9,10,11]。因此, 骨髓间充质

干细胞的增殖和分化已经成为骨质疏松的治疗靶点。

骨髓间充质干细胞的增殖和分化受到多种信号通路和相关蛋白的调控, 其中经典 Wnt/β-catenin

信号通路通过调节下游相关蛋白表达对成骨细胞分化和成骨脂肪源性反向分化进行调节

[12,13]。研究发现氯化锂能够通过调节 Wnt 信号通路中 β-catenin、GSK3β 和cyclinD1 蛋白表达

诱导毛囊干细胞的定向分化[14], GSK3β 作为 Wnt/β-catenin 通路中关键的调控蛋白参与细胞内

糖代谢过程, 对于干细胞的增殖、分化和凋亡具有重要的调控作用[15,16,17]。前期研究发现氯

化锂能够促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化, 然而其作用机制并不明确。因此, 该研究采用

不同浓度的氯化锂对大鼠骨髓间充质干细胞进行处理, 探讨氯化锂诱导骨髓间充质干细胞向成

骨细胞分化的作用机制。

 1 、材料和方法 Materialsandmethods

  1.1 、设计

随机分组, 对比观察体外细胞实验。

 1.2 、时间及地点

实验于 2017 年1月至 2018 年5月在黑龙江中医药大学方剂实验室完成。

 1.3 、材料

  1.3.1 、实验动物

4周龄 SPF 级健康雌性SD 大鼠 10 只, 体质量 180-200 g, 由黑龙江中医药大学提供, 动物合格证

编号SCXK 黑2015004。

 1.3.2 、实验药物与试剂

氯化锂 (Sigma, 美国) ;胎牛血清、α-MEM 培养基、青霉素- 链霉素混合液和胰酶(Hyclone, 美国)

;CCK-8 (同仁, 日本) ;GSK3β、p-GSK3β、β-catenin、GAPDH 抗体(Abcm 公司) ;维生素 C、β-甘

油磷酸钠、地塞米松(Sigma, 美国) ; 茜素红染液(索莱宝, 中国) ; 对硝基苯磷酸二钠 (PNPP) (大

连美伦, 中国) 。

 1.4、实验方法

  1.4.1 、骨髓间充质干细胞的分离和培养[18]

SD 大鼠采用颈椎脱臼法处死浸泡于体积分数为75%乙醇中10 min, 无菌条件下取双侧股骨、胫

骨以及肱骨, 置于无血清培养液中, 剪断双侧干骺端, 暴露出骨髓腔, 用1 mL 注射器吸取培养基

反复冲洗骨髓腔, 收集细胞冲洗液于离心管中, 800 r/min 离心 10 min, 弃上清, 用含有体积分数为

10%胎牛血清的完全培养液重悬细胞, 于体积分数为5%CO2、37℃培养箱内培养, 12 h 后换液,

去除未贴壁细胞, 以后每 3 d 换液 1次, 当细胞长满后传代, 应用倒置显微镜对细胞形态进行观

察。

1.4.2 、CCK-8 法检测骨髓间充质干细胞的增殖能力

将第 3代骨髓间充质干细胞浓度调整为1×107 L-1, 接种于 96 孔培养板, 每孔 200μL, 置于体积分

数为5%CO2 的37℃培养箱中进行培养, 待细胞长满瓶底 80%以上时, 每孔分别加入0, 2, 5

nmol/L 氯化锂继续培养 24 h, 每孔加入10μL CCK-8 继续培养 4 h, 用酶标仪在490 nm 波长下测

定吸光度值。

 1.4.3 、采用茜素红染色法检测成骨细胞钙化结节形成情况[19]

将细胞传代3次后, 在矿化诱导培养基 (100 nmol/L 抗坏血酸, 10 mmol/Lβ-甘油磷酸, 7 mol/L 地

塞米松) 中对细胞进行成骨性诱导培养。待细胞贴合至 80%后, 按终浓度分别为 0, 2, 5 nmol/L 加

入氯化锂培养 21 d, 弃培养液, PBS 冲洗细胞 3次, 体积分数为95%乙醇固定15 min, 加入0.1%茜

素红染色, 37℃孵育 1 h, 双蒸水冲洗 3次, 观察并照相。

1.4.4 、采用 PNPP 法测定成骨细胞的碱性磷酸酶活性[20]

细胞培养和处理方式同1.4.3。细胞培养 21 d 弃培养液, PBS 漂洗 2遍, 1%Triton X-100 反复冻融

3次, 细胞裂解物在37℃孵育于磷酸盐底物中30 min, 然后加入1 mol/L NaOH 终止反应, 405 nm

下测定吸光度值。

 1.4.5 、采用 Westernblot 法检测骨髓间充质干细胞中 wnt 信号通路相关蛋白含量

取第 3代对数期的大鼠骨髓间充质干细胞, 以每孔 2×104 个接种于 6孔培养板, 每孔 2 mL, 待细

胞贴壁后弃上清液, 按照实验分组给予 0, 2, 5 nmol/L 氯化锂干预, 每孔 2 mL。药物干预 2 d 后,

提取各组细胞总蛋白进行蛋白定量, 经12.5%SDS-PAGE 电泳分离, 转移至 PVDF 膜上, 用含 5%

脱脂奶粉的Tris-HCl 缓冲液室温孵育 1 h 后, 加入GSK3β, p-GSK3β, β-catenin 一抗 4℃过夜, 用

含吐温-20 的TBS 洗膜 3次, 每次 10 min, 加山羊抗兔二抗室温孵育 1 h, TBST 洗膜 3次, 每次 1

min, 加入辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素, 室温孵育 1 h, TBST 洗膜 3次, 每次 10 min, 采用

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骨髓间充质干细胞增殖分化中氯化锂的功能探究来源：中国组织工程研究作者：付殷;孙贵才;涂远青;发布于：2019-07-15共8083字摘要：背景:寻找促进骨髓间充质干细胞增殖及向成骨细胞分化的方法,可以为治疗骨质疏松类疾病提供治疗思路。目的:探讨氯化锂调控大鼠骨髓间充质干细胞增殖分化的机制。方法:实验采用全骨髓细胞接种法和贴壁纯化培养大鼠骨髓间充质干细胞,分别给予0,2,5nmol/L氯化锂进行干预;采用CCK-8法检测大鼠骨髓间充质干细胞的增殖情况,茜素红染色法检测钙化结节形成情况,PNPP法测定碱性磷酸酶活性,Westernblot法检测大鼠骨髓间充质干细胞中GSK3β,p-GSK...

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