铬离子对成骨的毒性作用及对Tnfrsf17基因表达的作用
铬离子对成骨的毒性作用及对 Tnfrsf17 基因表
达的作用
来源：学术堂 作者：姚老师
发布于：2014-08-29 共4361 字
目前, 临床上进行全髋关节置换术 (Total hiparthroplasty,THA) 所用金属假体主要为钴铬钼合金假
体。当假体植入人体后,在机械磨擦与电化学腐蚀的作用下,长期使用会产生严重磨损,磨损产生
大量的金属颗粒,释放大量金属离子,使得金属颗粒、离子在体内不断积聚。随后,积聚的金属离
子可以引起假体周围的骨质溶解及假体的无菌性松动,这是大多数 THA 失败的主要原因。有文
献报道,假体置换术后病人血液和尿液中以及关节囊中金属离子浓度远远超过生理所需,从而对
机体整体或局部产生一系列影响。Morais 等发现在体外培养中,铬和镍都可存留于骨髓细胞
中。磨损颗粒可以刺激肉芽组织内的巨噬细胞、成纤维细胞、巨细胞以及破骨细胞。同时,磨损
颗粒可以刺激炎性细胞因子和肽类因子的合成和释放增加, 例如 TNF-α、(IL) -1β,IL-6,IL-8,IL-
10,IL-12p40,IL-11、巨噬细胞趋化蛋白-1 等,这些都参与骨质溶解和骨量的丢失。
Tnfrsf17, 为B 细胞表面分子,属于肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor,TNFR) 家族,为
Ⅰ型跨膜受体。Tnfrsf17 主要表达于成熟的 B 淋巴细胞, 对于 B 细胞的成熟和自身免疫反应发挥
重要作用。Tnfrsf17 特异性的结合肿瘤坏死因子家族成员 13b(TNFSF13B / TALL-1 / BAFF) ,并
激活 NF-kappaB 和MAPK8 / JNK 通路。除此之外,Tnfrsf17 还可以与各种 TRAF 家族成员结合,
借此可以为细胞生存和分化传导信号。但是,据此前文献报导,Tnfrsf17 和BAFF-R 只表达于 B
细胞表面。
因此, 鉴于金属离子对机体的不良影响以及 Tnfrsf17 具备的细胞生存和分化传导信号作用,本实
验拟研究 Cr3 + 对成骨的毒性作用及对 Tnfrsf17 基因表达的影响。
1 、 材料与方法
1. 1 溶液配制 溶液配制所需玻璃器皿使用前均经去离子水浸泡冲洗, 烘干后盛制Cr3 +溶液。所
需CrCl3·6H2O 粉末购于美国 Sigma 公司,准确称量并溶于去离子水内制成母液备用。依次稀释
至目的浓度后使用火焰分光光度仪校正浓度。
1. 2 成骨细胞培养 SaO2 成骨细胞购买于武汉博士德生物公司, 培养于含体积分数 10% 的胎牛血
清的Mccoy’5A 培养液, 另外含100 U / ml 的青霉素- 链霉素。置于培养条件为37 ℃、5% 的CO2
孵箱中。每3 d 换液 1 次, 当瓶壁细胞丰度达 80% 左右后用 0. 25% 的胰蛋白酶消化传代。
1. 3 Cr3 + 对成骨细胞的干预浓度 胰蛋白酶消化传代12 h 后,待细胞完全贴壁后换液, 加入含Cr3
+的细胞培养液, 其浓度分别为0. 1、1. 3 和150 mg/L。
1. 4 细胞活性测定 96 孔板接种细胞, 每孔 5 000 个细胞, 每组设置5 个复孔。Cr3 + 溶液干预 24 h
后每孔加入 MTT (1 mg/ml) 50 μl,37 ℃孵育 4 h,吸去孔内液体, 加入 DMSO 液体 150 μl/孔,振荡
10 min, 用酶标仪选择 490 nm 波长测定各孔吸光度(A) 值,其值与细胞数量成正比。
1. 5 细胞钙结节测定 细胞贴壁后使用含Cr3 + 的培养液培养细胞 7 d, 每3 d 换液 1 次。按照 Von
Kossa 试剂盒说明书进行钙结节染色,并于低倍光学显微镜下观察,每个象限随机取一个低倍视
野, 计算每孔 4 个视野计数之和。
1. 6 碱性磷酸酶活性测定 各浓度培养液干预成骨细胞后于相应时间节点终止培养。各瓶加PBS
洗涤3次,加入 600 μl 0. 1% Tfiton X-100,于冰上用细胞挂刮除细胞,以使细胞膜破裂,离心,收集细
胞裂解液,- 80 ℃ 冻存。用 BCA 试剂盒测定总蛋白浓度, 碱性磷酸酶试剂盒测定 ALP 含量,最后
计算相对的 ALP 活性。
1. 7 RT-PCR 法及普通电泳检测 Tnfrsf17 基因 mRNA 的表达 Trizol 法提取细胞中 RNA, 使用
TOYOBO 反转试剂盒反转合成 cDNA, 以此为模版采用PCR 扩增试剂盒进行目的基因的扩增。
用TOYOBO SYBRqPCR 试剂盒进行 Real Time PCR 扩增。 用 PrimerPremier 5. 0 软件设计引
物, 引物由上海生工生物工程服务有限公司合成。反应总体积为 20. 0 μl,包括 5 μlDNA 模 版,10
μl 的Master Mix 缓冲 液,0. 2 μl20 mmol / L 的上下游引物,4. 6 μl ddH2O 。采用ABI7300 Real
Time PCR 仪, 按照机器说明书进行 40 循环(95 ℃ 15 s,60 ℃ 45 s) 。用 Light Cycler Software
version3. 5 进行数据分析, 基因的相对表达参照2ΔΔCt 法计算, 以GAPDH 作为内参照。电泳条
带通过凝胶灰度值可以对 Tnfrsf17 基因 mRNA 的表达进行辅助分析。引物序列如下:
1. 8 Western 法检测 Tnfrsf17 基因蛋白产物的表达 3 种浓度金属离子培养液干预成骨细胞后,于
相应时间节点终止培养。各瓶加PBS 洗涤3 次, 加入 600 μl 蛋白裂解液(RIPA PMSF = 100 ∶ ∶
1) ,于冰上用细胞挂刮除细胞,以使细胞膜破裂,离心,收集收集上清,BCA 法蛋白定量后调整蛋白
浓度一致。取等量与 SDS 混匀后煮沸 5 min,然后经电泳、转膜、封闭、抗体孵育和发光等步骤
后采用荧光化学发光凝胶成像分析系统检测蛋白表达,通过软件分析各组蛋白条带的灰度值并进
行比较。
1. 9 统计学方法 采用SPSS 18 统计软件进行分析, 计量资料用 x ± s �� 表示,组间比较用随机设
计的两样本均数比较, 随机区组比较采用方差分析及LSD-q 法,以P < 0. 05 为差异有统计学意
义。
2 、 结果
2. 1 成骨细胞活性及钙结节结果结果见图 1。Cr3 + 与成骨细胞共培养 24 h 后, 细胞 MTT 实验的
A 值明显下降。根据A 值计算细胞成活率,与对照组相比,0. 1、1. 3 和150 mg / L 组细胞成活率
分别下降了 2. 45% 、7. 32% 和22. 70% ,差异有统计学意义(P < 0. 05) 。与对照组相比,150 mg/L
组,Cr3 +对成骨细胞钙结节形成的影响较明显,差异有统计学意义(P <0. 05) 。
摘要：
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铬离子对成骨的毒性作用及对Tnfrsf17基因表达的作用来源：学术堂作者：姚老师发布于：2014-08-29共4361字目前,临床上进行全髋关节置换术(Totalhiparthroplasty,THA)所用金属假体主要为钴铬钼合金假体。当假体植入人体后,在机械磨擦与电化学腐蚀的作用下,长期使用会产生严重磨损,磨损产生大量的金属颗粒,释放大量金属离子,使得金属颗粒、离子在体内不断积聚。随后,积聚的金属离子可以引起假体周围的骨质溶解及假体的无菌性松动,这是大多数THA失败的主要原因。有文献报道,假体置换术后病人血液和尿液中以及关节囊中金属离子浓度远远超过生理所需,从而对机体整体或局部产生一系列影响...
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