对体外培养的髁状突软骨细胞施加张应力观察其生长
对体外培养的髁状突软骨细胞施加张应力观察
其生长
来源：学术堂 作者：韩老师
发布于：2014-08-21 共4287 字
引言 Introduction
功能矫形治疗是口腔正畸学中矫治患者下颌发育不足、后缩畸形的主要方法。颞下颌关节是人
体关节中能保持终生改建的惟一关节，而髁状突软骨作为下颌骨的主要生长中心，对矫形力的
反应直接而又敏感，是临床功能矫形治疗的主要功能区域，同时也是功能矫正器治疗下颌后缩
畸形的生物学理论基础。多种因素可以诱发髁突改建如创伤、增龄性变化、颞下颌关节盘移位
等，同时也是功能矫正器治疗下颌后缩畸形的生物学理论基础。是在使用功能矫正器对下颌后
缩畸形的临床矫正中，下颌向前移位，牵拉颞下颌关节韧带，将应力作用于颞下颌关节，髁突
软骨在所承受之力的不断作用下，发生相应的改建，髁状突在功能矫形下获得的垂直方向和水
平方向的生长对于下颌后缩的改善起到有效而且持久的作用。Chen 等研究中改变应力加载模
式能对髁状突软骨产生不同的生长刺激，髁状突软骨内各种生长因子水平发生不同变化。Ng
等研究中，重复的机械力刺激可以增加髁状突软骨中 Ihh 因子表达，而 Ihh 信号传导通路在软
骨骨化成熟过程中起到关键作用。但是由于在体内实验过程中，细胞力学的功能研究因其所处
生理环境的复杂性、刺激因素传导的不定向性，应力刺激对髁状突软骨细胞的直接影响需要进
一步实验研究。
髁状突软骨细胞是下颌骨生长、髁状突改建及创伤后修复的主要细胞，功能负荷改变诱导组织
中的间充质细胞增殖并分化为成软骨细胞，再继续分化为成熟的软骨细胞，形成软骨组织。髁
突软骨通过自分泌和旁分泌形式产生的细胞因子，形成复杂的代谢调控分子网络，各种细胞因
子之间相互拮抗或协同作用，调节酶及其抑制剂的活性，共同对软骨的代谢进行调控。在促进
髁突软骨生长改进的应力作用下，促进细胞生长和基质形成的细胞因子表达增强；在异常应力
的作用下，抑制细胞生长、促进基质降解的细胞因子表达增强。正畸治疗下颌后缩畸形中，功
能矫治器通对髁突施加一定的张应力刺激，引导其相应的生长因子调节下颌髁突生长来矫治下
颌骨发育不足。
为了对髁状突软骨细胞在张应力下的反应做进一步探讨，文章采用应力加载装置对体外培养的
髁状突软骨细胞施加一定的张应力，分析其生长改变，进一步阐述功能性矫正器对于下颌后缩
的病例的矫正机制。
1 材料和方法 Materials and methods
设计：细胞学体外实验。
时间及地点：于 2012 年1月至 2013 年12 月在青岛大学附属医院中心实验室完成。
材料：
实验动物：健康 2周龄新西兰白兔 1 只，雌雄不限，购自山东鲁抗医疗公 司 ，动物许
可证号 ： slxk-lu-20100109 。实验过程中对动物的处置符 合 2009 年《Ethical issues in
animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。
实验设备：多通道细胞牵张应力加载系统由通讯作者袁晓博士与哈尔滨工业大学共同研制，应
用Flexcell 公司生产的 BF-300lU BioFlex 弹性膜6孔培养板作为细胞培养单元，动力加载单元
使用 VCA5038B 型微型真空泵，并采用 C8051f410 单片机作为控制核心，通过编制相应的单片
机程序，从而实现多通道细胞牵张应力的检测与控制，根据对多通道细胞牵张应力控制实验系
统的设计要求，系统压检测范围：0-25 kPa；可以提供 0-20%的形变率，应变频率在0-0.5 Hz
内可调。【表】
方法：
细胞培养：选取 2周新西兰白兔，麻醉后局部消毒取髁状突软骨，用 PBS 充分漂洗 3次，将软
骨用手术剪剪至1 mm3 大小，PBS 冲洗 2次。加 0.25%胰蛋白酶大约 3 mL 至培养板中消化软
骨组织，5-10 min 震荡混勾 1次，消化30 min 后加入含血清的培养基终止消化，离心5 min(1
000 r/min)，将上清液吸去之后再向其中加入0.2%Ⅱ 型胶原酶约2 mL，用移液管将沉淀吹散，
放置于细胞培养箱中消化60 min，离心5 min(1 000 r/min)，得到沉降细胞，然后将含体积分数
10%血清的细胞培养基加入管里后吹打均匀，调整细胞浓度为1×105，在新的培养皿中开始培
养。
置于 37 ℃恒温，体积分数5%CO2，饱和湿度培养箱内培养。对通过以上培养技术得到的髁状
突软骨细胞进行体外鉴定(甲苯胺蓝染色)，并通过细胞形态观察、细胞生长曲线描记、计算细
胞倍增时间等对所培养细胞的生物学特性进行研究。
应力加载装置：多通道细胞应力加载装置采用 1个真空泵抽吸由特制弹性硅胶膜制成的培养皿
底部，形成负压使培养皿底部产生拉伸变形，从而使附底生长的细胞受机械牵张，细胞所受力
值大小以培养皿底部硅胶膜拉伸形变率(%)表示，形变率越大，表示细胞所受张力越大。
周期性张应力加载：在细胞培养至第3代时，调整细胞浓度为2×108L-1，并使之同步化生长后
转移至 6孔BioFlex 特制细胞培养皿中继续培养 48 h 待用。将待测细胞置于多通道细胞应力加
载系统内，施加 10%形变率、6循环/min 的周期性张应力，每一循环包括 3 s 拉伸/3 s 松弛；设
置相应的不加力对照组。分别在0，1，6，12 和24 h 时收集细胞，检测细胞的增殖情况。
流式细胞术测定髁状突软骨细胞增殖活性的变化：
加载应力完毕后，立刻收集髁状突软骨细胞于 15 mL 离心管中，同时收集相应对照组细胞。置
于离心机内 1 000 r/min 离心5 min，弃上清，然后加入预冷的PBS 5 mL，反复吹打，再以 1
000 r/min 离心5 min，弃上清，反复冲洗 3次，用 4 ℃体积分数75%乙醇 2 mL 固定髁状突软骨
细胞，将制备好的髁状突软骨细胞悬液置于 4 ℃冰箱过夜。上流式细胞仪检测前，将固定好的
细胞悬液，以 1 500 r /min 离心5 min，弃上清，加入DNA-Prep LPR 固定液100 μL，混匀 10
s，再加入DNA-Prep Stain 染料1 mL，混匀后室温避光 15 min，上机检测 S期细胞比率。
MTT 法检测应力加载对髁状突软骨细胞增殖的影响：在收集细胞前 4 h 每孔加入5 g/L 的MTT
200 μL，各组取5孔细胞。
加力结束时，吸除各孔内液体，每孔再加入DMSO1.5 mL，摇床振荡至染色颗粒完全溶解，使
用加样枪吸取液体至 96 孔板，每孔 200 μL，以不含细胞的无血清 RPMI-1640 培养液作为空白
调零孔，上全自动酶标仪，492 nm 测定吸光度值(A)。
摘要：
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对体外培养的髁状突软骨细胞施加张应力观察其生长来源：学术堂作者：韩老师发布于：2014-08-21共4287字引言Introduction功能矫形治疗是口腔正畸学中矫治患者下颌发育不足、后缩畸形的主要方法。颞下颌关节是人体关节中能保持终生改建的惟一关节，而髁状突软骨作为下颌骨的主要生长中心，对矫形力的反应直接而又敏感，是临床功能矫形治疗的主要功能区域，同时也是功能矫正器治疗下颌后缩畸形的生物学理论基础。多种因素可以诱发髁突改建如创伤、增龄性变化、颞下颌关节盘移位等，同时也是功能矫正器治疗下颌后缩畸形的生物学理论基础。是在使用功能矫正器对下颌后缩畸形的临床矫正中，下颌向前移位，牵拉颞下颌关节韧带...
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