低强度脉冲场超声对充质干细胞的增殖作用研究

3.0 闻远设计 2024-07-13 20 4 131.85KB 4 页免费

侵权投诉

低强度脉冲场超声对充质干细胞的增殖作用研

究

来源：海南医学作者：黄邓高;高元慧;王顺兰

发布于：2017-06-29 共4785 字

【摘要】目的运用低强度脉冲场超声（LIPUS）刺激促进人脂肪间充质干细胞（hASCs）增

殖，为临床干细胞体外高效增殖提供新方法。方法通过 LIPUS 体外刺激 hASCs 细胞生长，采

用Scepter 2.0 手持细胞计数器进行细胞计数，运用荧光倒置显微镜观察细胞形态，运用流式细

胞仪检测细胞表面标志物，并进行干细胞临床前质量检测。结果刺激组 50 mW/cm2 和60

mW/cm2 的LIPUS 刺激强度均能促进细胞增殖，60 mW/cm2 强度更显着，与对照组比较差异均

具有统计学意义（P<0.05）；细胞倍增时间比对照组缩短，差异具有统计学意义（P<0.05），

刺激后刺激组细胞表面标志物无变化，增殖后干细胞质量检测符合标准要求。结论 LIPUS 刺激

可促进 hASCs 有效增殖，低强度脉冲场超声可作为干细胞体外扩增的新方法。

【关键词】低强度脉冲场超声；人脂肪间充质干细胞；细胞增殖；质量检测。

低强度脉冲场超声（low-intensity pulsed ultra-sound,LIPUS）作为高频、小振幅和脉冲压力波传

递机械刺激经皮进入生物组织的一种非侵入性的治疗方式[1]

,目前被广泛应用于临床治疗。有报道，LIPUS 刺激既促进细胞 DNA 和蛋白质合成[2],又促进细

胞对钙的吸收[3].LIPUS 亦可提高细胞活性、细胞因子释放、基因表达、矿化率、Akt 信号、钾

流动、血管生成、腺苷酸环化酶活性和 TGF-β 合成的影响等[4-6],对再生医学具有重要意义。

脂肪间充质干细胞（adipose tissue-derived mesen-chymal stem cells,ASCs）由于其来源广、且容

易获得等特点，已经成为新一代组织工程种子细胞的来源之一。随着近年来干细胞研究领域的

快速发展，人们对干细胞生物学的了解越来越深入。人脂肪间充质干细胞（hASCs）因具有低

的免疫原性和强大的免疫调节特性，被用于同种异体的细胞移植等，治疗多种疾病和组织损伤

[7-8],促进了干细胞移植和再生医学的发展。

LIPUS 促进体内组织的修复，那么它应先促进体内细胞增殖然后再作用于损伤部位。然而，以

往的研究者未见运用 LIPUS 对hASCs 细胞增殖的研究，且促进细胞增殖机制未明确。本实验

中，我们运用 LIPUS 刺激促进 hASCs 增殖，增殖后干细胞质量检验符合要求，实验结果为

hASCs 体外高效扩增和产业化提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞来源

人脂肪间充质干细胞购自广州赛业生物科技有限公司，按标准操作进行培养和传代[9-11].

1.1.2 仪器和试剂

人脂肪间充质干细胞完全培养基（广州赛业生物科技有限公司）；0.25%胰酶消化液（Gibco

公司）；流式抗体CD105-PE、CD73-PE、CD34-PE、CD14-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE 和

HLA-ABC-PE （广州BD 公司）；支原体培养和鉴定药敏检测试剂盒（中山市天祥电子生物传

感器有限公司）；实时定量PCR 法检试剂盒（中山达安基因检测有限公司）；细菌内毒素检

查试剂盒（厦门市鲎试剂实验厂有限公司）；快速革兰氏染色试剂盒（珠海贝索生物技术有限

公司）；细胞培养皿、12 孔板、50 mL 离心管（Grenier 公司）；手持细胞计数仪（Merck

Millipore 公司）；细胞扩增仪 SonaCell （加拿大Intelligent-Nano 公司）；细胞培养箱（美国

Ther-mo ）；实时定量PCR 仪（瑞士罗氏公司）；荧光倒置显微镜（日本 Olympus 公司）。

1.2 方法

1.2.1 SonaCell

细胞扩增仪 LIPUS 刺激 Sona-Cell （Jie Chen 提供）超声设备是基于生物学和临床研究的基础

上设置的：超声频率为 1.5 MHz,脉冲重复频率为 1 kHz,脉冲循环为 20%.超声平均强度可调整在

0~100 mW/cm2.仪器探头通过耦合剂紧贴培养皿底部进行辐照，本实验选用SonaCell 细胞扩增

仪40 mW/cm2、50 mW/cm2、60 mW/cm2 强度的 LIPUS 刺激[12]为刺激组，0 mW/cm2 强度为

对照组。取hASCs 第3代细胞 2×104 个的密度1 mL 接种于 12 孔板相应的孔中，细胞培养 24 h

后换液，然后使用SonaCell 设备的LIPUS 刺激部件于细胞培养箱中刺激，5 min/d,连续刺激 4d

（即细胞培养 24 h、48 h、72 h、96 h），第5天收集细胞并计数。细胞倍增时间（population

doubling time,PDT）计算方法：t=T/3.32 （lgN2-lgN1），T为对数期的持续增长时间，N1 和

N2 分别是对数增长开始和结束的细胞数量。做5组重复实验，对数据进行统计学分析。

1.2.2 细胞计数

运用 Scepter 2.0 手持细胞计数器进行细胞计数，用 0.25%胰酶-EDTA 消化液消化并收集细胞，

用适量的 D-PBS 重悬细胞，取150 ?L 细胞悬液至 1.5 mL 离心管中，使用Scepter 2.0 计数器的

60 ?L 感应探头插入液面以下。根据制造商的说明书进行操作。使用Scepter Software Pro 软件

进行数据分析，准确测量细胞的直径和每毫升体积内细胞的数量。

1.2.3 细胞形态观察

由于细胞生长至第 5 天（120 h）后，显微镜下观察不好分辨细胞的数量。本实验选择第 2次刺

激后 12 h （即细胞培养 60 h），对数生长期初始阶段，将刺激组和对照组细胞置于倒置显微镜

下观察，运用 Image-Pro Plus 软件拍照。

1.2.4 hASCs

免疫表型测定通过流式细胞仪测定hASCs 刺激组与对照组表面标记物

CD105、CD73、CD34、CD14、CD45、HLA-DR 和HLA-ABC 的表达情况。取消化待测细

胞，用 D-PBS 缓冲液清洗两次。调整细胞浓度为 3×105 个/mL,加入适量荧光标记的单克隆抗

体，室温，避光孵育 30 min.再清洗一次，重悬，上机检测，运用 BD FACSDIVA 软件进行分

析。

1.2.5 取第 3 代刺激后 hASCs 进行无菌试验、支原体检测、内毒素检测、革兰氏染色、人源特

定病毒检测

参照《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》和《中华人民共和国药典》2010 年版三部

附录进行[13-14].

1.3 统计学方法

应用 SPSS20.0 统计学软件包进行数据分析，采用 GraphPad Prism6 软件作图。首先对数据行正

态性检验，若不符合正态分布，通过正态性转换后再下一步处理。组内比较采用 One-

wayANOVA 检验方法，组间比较采用独立样本 t 检验，以 P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LIPUS 刺激促进 hASCs 体外增殖 LIPUS 刺激 hASCs 体外增殖，第5 天计数结果显示刺激

组50 mW/cm2 和60 mW/cm2 强度都有促进细胞增殖的效果，其中60 mW/cm2 刺激强度最明

显，细胞倍增时间较对照组缩短，差异均有统计学意义（P<0.05），见图 1和图2.

文档加载中……请稍候！
如果长时间未打开，您也可以点击刷新试试。

下载文档到电脑，查找使用更方便

免费 4人已下载

立即下载

摘要：

低强度脉冲场超声对充质干细胞的增殖作用研究来源：海南医学作者：黄邓高;高元慧;王顺兰发布于：2017-06-29共4785字【摘要】目的运用低强度脉冲场超声（LIPUS）刺激促进人脂肪间充质干细胞（hASCs）增殖，为临床干细胞体外高效增殖提供新方法。方法通过LIPUS体外刺激hASCs细胞生长，采用Scepter2.0手持细胞计数器进行细胞计数，运用荧光倒置显微镜观察细胞形态，运用流式细胞仪检测细胞表面标志物，并进行干细胞临床前质量检测。结果刺激组50mW/cm2和60mW/cm2的LIPUS刺激强度均能促进细胞增殖，60mW/cm2强度更显着，与对照组比较差异均具有统计学意义（P...

展开>> 收起<<

低强度脉冲场超声对充质干细胞的增殖作用研究.docx

共4页,预览2页

还剩页未读，继续阅读

低强度脉冲场超声对充质干细胞的增殖作用研究

相关推荐

开通VIP享超值会员特权

作者详情

相关内容

推荐作者

热门标签

举报选择: