成熟的BMMSCs细胞培养模型的建立

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成熟的 BMMSCs 细胞培养模型的建立

来源：学术堂作者：周老师

发布于：2014-05-19 共3799 字

人骨髓间充质干细胞( bone marrow mesenchy-mal stem cells，BMMSCs) 具有较强的增殖和多向

分化潜能，相较于胚胎干细胞、脐血干细胞和神经干细胞，其伦理学限制较少，有利于基础和

临床研究的大范围开展，且 BMMSCs 自体移植免疫原性更低，可作为良好的供体与宿主细胞

进行更好的整合，是治疗中枢神经系统疾病的理想载体。但 BMMSCs 在骨髓细胞中所

占比例较小，且分化细胞存活时间较短。本研究旨在建立成熟的细胞培养模型，以获得大量

纯度较高的BMMSCs ，并提高 BMMSCs 向神经细胞分化后的存活时间，为

BMMSCs 的临床应用提供实验基础。

1 材料与方法

1 ．1 骨髓采集选取 2005 年6 月在郑州大学医学院第一附属医院门诊因不明原因发热就诊的患

者5 例，其中男 2 例，女 3 例，年龄 20 ～51 岁，平均( 36. 40 ±11 ．61) 岁。无菌条件下用骨

髓穿刺针在髂骨处抽取骨髓，每例 3 ～5 mL ，置于 4 ℃抗凝管中备用。患者对实验知情同意。

1 ．2 主要试剂与仪器 Dulbecco's 改良 Eagle 培养基( Dulbecco' s modified Eagle' s

medium，DMEM/F12) ( 美国 Gibco 公司) ，胎牛血清( fetal bocine ser-um，FBS) ( 美国 Hyclone

公司) ，β-巯基乙醇( β-mer-captoethanol，BME) 、3-丁基-4-羟基茴香醚( 3-tert-bu-ty-4-

hydroxyanisole，BHA) 、二甲基亚砜( dimethylsul-foxide，DMSO) 、脑源性神经生长因子

( brain-derivedneurotrophic factor，BDNF) 、牛血清蛋白( bovine ser-um albumin，BSA) ( 美国

Sigma 公司) ，淋巴细胞分离液( 天津森润生物技术有限公司) ，磷酸盐缓冲液( phosphate buffer

solution，PBS) ( 北京康为世纪生物科技有限公司) ，山羊抗人神经元特异性烯醇化酶( neuron

specific enolase，NSE) 多克隆抗体、异硫氰酸荧光素( fluorescein isothiocyanate，FITC) 标记兔

抗山羊二抗( 北京中杉生物技术有限公司) 。倒置显微镜( 日本Olympus 公司) ，细胞培养箱( 美

国Thermo 公司) ，高速离心机( 上海安亭科学仪器厂) ，医用净化工作台( 苏州高新净化工程有

限公司) 。

1 ．3 BMMSCs 分离培养用无菌 PBS( pH = 7 ．2) 将抗凝骨髓 1 1 ∶ 稀释混匀，再1 1 ∶等体积

叠加到淋巴细胞分离液上，1 800 r·min －1 离心20 min。Pasteur 吸管吸取单核细胞层，PBS 洗

涤后加入含体积分数15%FBS 的DMEM/F12 完全培养液，调整细胞密度至1 × 109L －1，接种

于培养瓶，37 ℃ 体积分数5%CO2 细胞培养箱培养。倒置显微镜观察细胞生长情况。

1 ．4 BMMSCs 传代培养原代细胞( P0) 贴壁生长达80% 融合时加入 37 ℃ 质量分数0 ．25%的

胰蛋白酶 1 mL 消化贴壁细胞。待细胞收缩变圆，细胞间隙不断增大，加入含 FBS 的

DMEM/F12 培养液终止消化。Pasteur 吸管吹打使贴壁细胞完全悬浮，PBS 洗涤后，加入

DMEM/F12 完全培养液置培养箱中传代培养。倒置显微镜下观察细胞生长情况。

1 ．5 BMMSCs 分化培养选第 4 代细胞( P4) 以1 × 108L －1 细胞密度接种于培养瓶和6 孔板中

( 孔中预置用多聚赖氨酸处理的盖玻片) ，待细胞生长达到 80% 融合时弃去培养液，诱导组加

入含体积分数20%FBS 预诱导剂( DMEM / F12 + 1 × 10 －3mol · L －1BME + 50 μg·L －

1BDNF) ，24 h 后去除预诱导剂，再加入含体积分数2% DMSO 诱导剂( DMEM/F12 +1 × 10 －

3mol·L －1BME + 2 × 10 －4mol·L －1BHA +50 μg·L －1BDNF) 进行诱导。对照组不加预诱导

剂和诱导剂。倒置显微镜观察细胞生长情况。

1 ．6 免疫荧光细胞化学染色分化细胞进行 NSE 免疫荧光染色。取生长有细胞的盖玻片，体积

分数4% 多聚甲醛固定 10 min ，体积分数3% H2O2 室温孵育 10 min ，体积分数5%BSA 封闭

10 min ，加入山羊抗人 NSE 多克隆抗体( 1 200) ∶ ，并设阴性对照，用 PBS 代替一抗，4 ℃ 过

夜，37 ℃ 孵育 2 h ，然后在避光条件下，加入 FITC-标记兔抗山羊二抗，37 ℃ 孵育 40 min 后

荧光封片剂封片。

1 ．7 细胞增殖活性的测定收集不同发育阶段的细胞，分为对照组和诱导组。诱导前

P4BMMSCs 为对照组，诱导分化细胞为诱导组。诱导组又分为诱导 1 d 组( 诱导分化第 1 天细

胞) 、诱导 2 d 组( 诱导分化第 2 天细胞) 和诱导 3 d 组( 诱导分化第 3 天细胞) 。将4 组细胞进

行碘化丙啶染色: 细胞经 PBS 洗涤，用体积分数70%的乙醇固定，500 μL ＲNaseA 酶缓冲液

( 100 mg·L －1ＲNaseA + 20 mg·L －1碘化丙啶) 避光染色 30 min。用流式细胞仪分析细胞周

期变化。每组计数 10 000 个细胞。

1 ．8 统计学处理应用 SPSS 13 ．0 软件进行统计分析，计量资料以均数± 标准差( x ± s) ��

表示，组间比较采用 t 检验，P ＜0 ．05 为差异有统计学意义。

2 结果

2 ．1 BMMSCs 的分离和传代培养骨髓离心获得单个核细胞接种培养 72 h 后，可见有少许细

胞开始贴壁生长，其胞体狭长，散在分布( 图1A) 。7 ～9 d，部分长梭形细胞增殖形成集落，

未贴壁细胞在连续换液中被不断清除。15 ～20 d，梭形细胞呈极性或旋涡状排列，形态一致(

图1B) 。传代后，细胞增殖旺盛，其形态保持梭形无变化。随传代次数增加，BMMSCs 得到

不断纯化和扩增。

2 ．2 BMMSCs 的分化培养及鉴定对BMMSCs 进行诱导，加入预诱导剂24 h 后，梭形细胞折

光性降低。加入诱导剂2 h 后即可见其胞体开始向细胞核方向收缩，并伸出较短突起。6 h 后胞

体收缩呈圆形，折光性强，细胞突起继续延长，类似于神经元轴突的单个长突起，呈典型神经

元的形态( 图2) 。细胞诱导 4 ～10 h ，对分化细胞固定进行 NSE 免疫荧光染色，阳性细胞呈绿

色荧光( 图3) 。

2 ．3 细胞增殖活性的测定将 S + G2/ M 期的细胞百分比作为增殖指数( proliferation index，PI)

判定细胞增殖活性。结果显示，诱导前 P4 细胞( 对照组) PI 较高，说明细胞增殖旺盛，增殖能

力较强。与对照组比较，诱导后的细胞发生 G0/ G1 期阻滞，各诱导组 S 期细胞比例及PI 均显

着降低( P ＜0 ．01) ，说明细胞增殖明显抑制。而各诱导组之间细胞比例无明显变化( P ＞0 ．

05) ，说明细胞处于较稳定的存活及分化状态; 见表 1 。

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成熟的BMMSCs细胞培养模型的建立来源：学术堂作者：周老师发布于：2014-05-19共3799字人骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchy-malstemcells，BMMSCs)具有较强的增殖和多向分化潜能，相较于胚胎干细胞、脐血干细胞和神经干细胞，其伦理学限制较少，有利于基础和临床研究的大范围开展，且BMMSCs自体移植免疫原性更低，可作为良好的供体与宿主细胞进行更好的整合，是治疗中枢神经系统疾病的理想载体。但BMMSCs在骨髓细胞中所占比例较小，且分化细胞存活时间较短。本研究旨在建立成熟的细胞培养模型，以获得大量纯度较高的BMMSCs，并提高BMMSCs向神经细胞分化后...

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