沉默型pEGFP-shRNA-wnt3a粒子对内皮祖细胞增值的改变

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沉默型 pEGFP-shRNA-wnt3a 粒子对内皮祖细

胞增值的改变

来源：学术堂作者：姚老师

发布于：2015-09-25 共3923 字

内皮祖细胞（ endothelial progenitor cells,EPCs）是一群具有游走特性，能进一步增殖分化的幼

稚内皮细胞；缺乏成熟内皮细胞的特征性表型，是血管内皮细胞的前体细胞；具有增殖、迁

移、分化成内皮细胞和聚集形成新生血管的作用，主要参与出生后缺血组织的血管发生和血管

损伤后的修复。Wnt3a 是wnt 家族的重要成员之一，其对细胞的增殖与分化等过程有重要的调

控作用。本实验以大鼠 wnt3a 基因为靶点，构建沉默型 pEGFP-shRNA-wnt3a 重组质粒载体，

并用脂质体介导转染大鼠骨髓源性 EPCs, 观察 wnt3a 蛋白表达水平的改变及对细胞增殖的影

响，为进一步研究 wnt3a 及其下游靶基因调节 EPCs 的功能研究提供实验基础。

1 材料与方法

1. 1 材料

1. 1. 1 实验动物 SD 大鼠 15 只，90 ~ 120 g,SPF 级，雄性，由安徽医科大学实验动物中心提

供。

1. 1. 2 主要试剂 EGM-2 完全培养基购自瑞士 Lonza 公司；淋巴细胞分离液购自天津 TBD 公

司；大鼠纤维联接蛋白（ rat fibronectin,FN ）购自瑞士 GeneOperation 公司； CD133 抗体购自

美国 Biorbyt 公司；Dil 标记的乙酰低密度脂蛋白（ Dil-ac-LDL ）购自美国 Invitrogen 公司；异

硫氰酸荧光素荆豆凝集素-1 （FITC-UEA-1 ）购自美国 Sigma 公司；重组质粒（pEGFP-

shRNA-wnt3a ）购自合肥昊翔生物科技有限公司；脂质体 Lipofectamine 2000 购自美国

Invitrogen 公司； wnt3a 一抗购自美国 Cell Signaling 公司；二抗购于上海碧云天生物技术有限

公司。

1. 2 方法

1. 2. 1 EPCs 的采集、分离和培养取 90 ~ 120 g 大鼠颈椎脱臼法处死，无菌操作台中取股骨及胫

骨骨髓血，采用密度梯度离心法分离纯化单核细胞；用含 10%FBS 的EGM-2 完全培养基，吹

打分散细胞，计数细胞并以 1 ×107/ ml 的密度接种预包被 FN 的培养瓶；置于 37 ℃、5% CO2

的恒温细胞培养箱中培养 4 d, 弃去未贴壁细胞；以后每隔 2 d 后换液 1次，每天观察并记录细

胞生长形态变化。约 8 ~ 10d 后，细胞铺满瓶底即可传代。

1. 2. 2 EPCs 的鉴定

1. 2. 2. 1 EPCs 免疫细胞化学 CD133 及VEGFR-2 双抗体荧光检测取生长良好的原代 EPCs,用胰

酶消化并接种于装有盖玻片的24 孔培养板中，置于 37 ℃ 、5% CO2 的恒温细胞培养箱中；次

日显微镜下可见 EPCs 生长良好，PBS 漂洗 3 遍，每遍5 min; 加入 4% 多聚甲醛固定 20 min,0.

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摘要：

沉默型pEGFP-shRNA-wnt3a粒子对内皮祖细胞增值的改变来源：学术堂作者：姚老师发布于：2015-09-25共3923字内皮祖细胞（endothelialprogenitorcells,EPCs）是一群具有游走特性，能进一步增殖分化的幼稚内皮细胞；缺乏成熟内皮细胞的特征性表型，是血管内皮细胞的前体细胞；具有增殖、迁移、分化成内皮细胞和聚集形成新生血管的作用，主要参与出生后缺血组织的血管发生和血管损伤后的修复。Wnt3a是wnt家族的重要成员之一，其对细胞的增殖与分化等过程有重要的调控作用。本实验以大鼠wnt3a基因为靶点，构建沉默型pEGFP-shRNA-wnt3a重组质粒载体，并用...

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