藏獒皮肤成纤维细胞系的体外培养及其生物学特征

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藏獒皮肤成纤维细胞系的体外培养及其生物学

特征

来源：学术堂作者：周老师

发布于：2014-05-24 共7704 字

藏獒（ＴｉｂｅｔａｎＭａｓｔｉｆｆ）属食肉目（Ｃａｒｎｉｖｏｒａ）犬科（Ｃａｎｉ

ｄａｅ），是原产于青藏高原地区的古老犬种，也是中国唯一的一个大型犬种，属于国家二级

保护动物。由于近几十年来藏獒被大量贩运到内地省份，甚至国外，加上当地生存环境恶化，

青海、西藏等原产地优良藏獒数量剧减，正面临着种群资源流失的危险（郭宪等，２００

８）。国内约２０年前才开始了对藏獒的认识与研究，主要研究集中在藏獒疾病防治、饲养管

理、繁殖培育、品种鉴别等方面，少量研究涉及藏獒血液生理生化特征（李动等，２００

０）、种群遗传多样性（Ｌｉ等，２００８）、选配选育（崔泰保等，２００９）、精液保存

（郑筱峰等，２０１０）等方面，而细胞、分子方面的研究较少。国外有研究报道应用动物体

细胞克隆技术生产克隆狗获得成功（Ｊａｎｇ等，２００８），国内尚未开展此项研究的报

道。体细胞克隆技术已成为保护珍稀动物资源的新方法。目前在国内已建立了大熊猫（张明

等，２００６）、黑麂（方俊顺等，２００７）、朱�q（王金焕等，２０１２）等珍稀动物

皮肤成纤维细胞系进行细胞生物学特性和遗传资源保护研究。本研究利用组织块法建立了２株

藏獒皮肤成纤维细胞系，对其体外培养的培养条件、生长特性、冷冻复苏、波形蛋白表达、细

胞核型进行了研究，为藏獒体细胞克隆研究提供了供体细胞。

１材料与方法

１．１试剂及仪器ＰＢＳ、ＤＭＥＭ、Ｄ／Ｆ－１２、ＴＣＭ１９９、胰蛋白酶和乙二胺四

乙酸二钠混和溶液、胎牛血清、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ均购自Ｇｉｂｃｏ公司；二甲亚砜购自Ａｍ

ｅｒｉｓｃｏ公司；Ｇｉｅｍｓａ染料、台盼蓝染料均购自上海生工生物工程技术服务有限公

司。

台式离心机购自Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司；二氧化碳培养箱购自三洋公司；超净工作台购自东

联哈尔公司；倒置荧光显微镜购自尼康公司。

１．２皮肤组织的获取与处理２只３月龄藏獒（１公１母）经耳部剪毛、清洗和消毒后，剪取

皮肤组织约０．５ｃｍ２，放入磷酸缓冲液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌ

℃ｉｎｅ，ＰＢＳ）溶液，４下２ｈ内运回实验室。用ＰＢＳ溶液反复冲洗组织块８～１０

次，用手术刀片刮去组织表面毛根及部分表皮，用眼科剪刀去除软骨，将皮肤组织剪成约１ｍ

ｍ３小碎块。组织块经ＰＢＳ溶液反复洗涤４次，用细胞培养液（Ｄ／Ｆ－１２添加２０％胎

牛血清、１００ＩＵ／ｍＬ青霉素、１００ μｇ／ｍＬ链霉素、４０μｇ／ｍＬ表皮生长因

子）离心洗涤３次，用１ｍＬ细胞培养液重新悬浮。

１．３细胞培养为了增加组织块贴壁能力，先用胎牛血清涂布Ｔ２５细胞培养瓶（Ｃｏｒｎｉ

ｎｇ）底部，然后用吸管将组织块转移至细胞培养瓶，用牙科探针将组织块摆放于瓶底部，每

瓶５～８块。将培养瓶倒置放入ＣＯ２培养箱培养２～４ｈ后，加入３ｍＬ细胞培养液翻转培

养瓶继续培养，每３ｄ更换１次细胞培养液，观察细胞生长情况。当细胞从组织块周围游离出

来并向周围成片生长时进行传代，用ＰＢＳ溶液洗涤２次，用牙科探针挑取组织块，加

℃入２ｍＬ０．２５％胰蛋白酶和０．０４％乙二胺四乙酸二钠混和溶液于３７消化细胞３ｍ

ｉｎ，加入２ｍＬ细胞培养液终止消化，于１０００ｒ／ｍｉｎ离心细胞，弃上清，用细胞培

养液重新悬浮细胞，计数后以５×１０４／ｍＬ的密度接种于新培养瓶继续培养。经过５～７

ｄ生长后，细胞达到８５％～９０％汇合，再次按１∶３或１∶４比例进行传代培养。

１．４细胞冻存与复苏生长中的细胞达到８５％～９０％汇合时可以进行细胞冻存，经ＰＢＳ

℃洗涤，胰酶消化、离心后，在每一个Ｔ２５培养瓶细胞沉淀物中加１ｍＬ预冷至４的细胞冻

存液（Ｄ／Ｆ－１２添加１０％胎牛血清、１０％二甲亚砜），移到细胞冻存管（Ｃｏｒｎｉ

℃ ℃ｎｇ），放入细胞冻存盒（Ｎａｌｇｅｎｅ）于４平衡０．５ｈ后，转移到－８０低温

℃冰箱保存２４ｈ后，将细胞冻存管投入液氮保存。复苏细胞时，将冻存管于３７水浴中快速

摇动解冻细胞，移到１５ｍＬ离心管，加入９ｍＬ细胞培养液混匀，离心沉淀细胞，加入５ｍ

Ｌ细胞培养液重新悬浮细胞，移到Ｔ２５细胞培养瓶培养，２４ｈ后换培养液去除漂浮

的死亡细胞。

１．５细胞生长曲线绘制取２瓶生长至８５％汇合的Ｆ４代细胞用胰酶－ＥＤＴＡ混合液消

化，用细胞培养液将细胞稀释至１×１０４／ｍＬ、３×１０４／ｍＬ和５× １０４／ｍＬ３

种密度，分别加入２４孔细胞培养板（ＮＵＮＣ）孔中，每孔１ｍＬ，第１列加３孔，

共加１０列。将培养板放入培养箱中，每２ｄ更换１次培养液。从第１列开始每天在固定时间

取出培养板消化３个孔的细胞，稀释后用血球计数板进行细胞计数，取其平均值，以天数作为

横坐标，以细胞数作为纵坐标，绘制细胞生长曲线。可用以下公式求得细胞群体倍增时间（ｐ

ｏｐｕｌａｔｉｏｎｄｏｕｂｌｉｎｇｔｉｍｅ，ＰＤＴ）。

式中，ｔ代表培养时间；Ｎ０代表首次计数获得的细胞数；Ｎｔ代表培养ｔ时间后的细胞计

数。

１．６细胞波形蛋白免疫荧光分析参考Ｂｏｎｉｆａｃｉ－ｎｏ等（２００７）方法，稍作修

改。将细胞悬液按每孔４ｍＬ的量加入预先放置盖玻片（ＮＵＮＣ）的６孔板内，培养到细胞

至５０％～７０％汇合。吸出培养基，每孔加入含２％甲醛的ＰＢＳ，室温孵育１０ｍｉｎ，

吸出甲醛，ＰＢＳ洗涤２次。在盖玻片上，加２ｍＬ含１０％ＦＢＳ的ＰＢＳ，放置１０～２

０ｍｉｎ。用含０．２％～０．５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００和１０％ＦＢＳ的ＰＢＳ稀释一

抗（ｍｏｎｏ－ｃｌｏｎａｌａｎｔｉ－ｖｉｍｅｎｔｉｎａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｏｄ

ｕｃｅｄｉｎｍｏｕｓｅ，１ｍｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ－ＡＬＤＲＩＣＨＩｎｃ．）于

１．５ｍＬ离心管中，稀释比例为１∶１０００。用高速离心机最大速度离心抗体稀释液和对

照组溶液，从沉淀物中吸出抗体溶液。加一抗２５μＬ，用镊子取出盖玻片，再将其置于２５

μＬ的一抗溶液内，细胞面向下。室温于湿盒内孵育１ｈ。取出盖玻片，细胞面朝上，加入含

１０％ＦＢＳ的ＰＢＳ，放置５ｍｉｎ后吸出溶液，重复２次以上。用含０．２％～０．５％

Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００和１０％ＦＢＳ的ＰＢＳ溶液稀释二抗（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ

（ＦＩＴＣ）－ｃｏｎ－ｊｕｇａｔｅｄａｆｆｉｎｉｐｕｒｅｇｏａｔａｎｔｉ－ｍ

ｏｕｓｅＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），９．０ｍｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ－ＡＬＤＲＩＣＨＩｎ

ｃ．），稀释比例为１∶１００，混匀后离心除去沉淀。在盖玻片上加一滴二抗２５μＬ，将

盖玻片置于二抗溶液内，盖上培养皿盖，避光存放，室温孵育１ｈ。取出盖玻片，细胞面朝

上，放入培养板，加入含１０％ＦＢＳ的ＰＢＳ，放置５ｍｉｎ，再吸出溶液；重复２次以

上。滴加含０．２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００和１０ μ ｇ／ｍＬＰＩ（ｐｒｏｄｉｐｉｕｍ

ｉｏｄｉｄｅ）的ＰＢＳ孵育２ｍｉｎ，用ＰＢＳ洗涤３次。用抗荧光淬灭封片剂（ｆｌｕｏ

ｒｏｍｏｕｎｔ－ＧＴＭ，ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇ－ｈａｍ

ＵＳＡ）封片后，在荧光显微镜下观察。ＦＩＴＣ用４９２ｎｍ激发光，ＰＩ用５３５ｎｍ激

发光。通过与对照组比较，确定非特异染色区域。

１．７细胞核型分析参考Ｆｒｅｓｈｎｅｙ等（２００８）方法，稍作修改。将５ｍＬＦ５

代细胞悬液以３×１０４／ｍＬ密度接种在Ｔ２５培养瓶中培养３～５ｄ后，加入秋水仙素使

其终浓度为０．３ μｇ／ｍＬ，作用４ｈ。用胰酶消化细胞，离心后，加入０．０７５ｍｏｌ

℃／ＬＫＣＩ混悬细胞，３７静置１３ｍｉｎ。加入冰冷的醋酸甲醇，混合后离心，弃上

清，边振荡边加入醋酸甲醇，冰上静置１０ｍｉｎ。离心细胞，弃上清，加入０．１～０．２

ｍＬ醋酸甲醇，振荡混悬细胞。用吸管将细胞悬液从３０ｃｍ处滴到凉的玻片上，倾

斜玻片让液滴铺展开。火焰干燥玻片后，用相差显微镜观察，如细胞均匀铺展，制作更多的玻

片。在玻片上加数滴纯Ｇｉｅｍｓａ染液，染色４ｍｉｎ，流水冲洗，干燥。在玻片上滴加１

滴二甲苯，盖上盖玻片，在油镜下观察分散良好的染色体并拍照。用Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ软件

剪切单个染色体，成对排列后，用尼康显微镜（ＮｉｋｏｎＥｃｌｉｐｓｅＴｉ）图像处

理软件（ＮＩＳ－ＥｌｅｍｅｎｔｓＢＲ３．００，ＳＰ１）进行染色体数据测量。

２结果与分析

２．１藏獒皮肤成纤维细胞体外培养生长情况及形态特征用组织块法建立了２株藏獒皮肤成纤

维细胞系，组织块经贴壁培养５～７ｄ，周围可见梭形或铺路石样多边形细胞游出并向四周生

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藏獒皮肤成纤维细胞系的体外培养及其生物学特征来源：学术堂作者：周老师发布于：2014-05-24共7704字藏獒（ＴｉｂｅｔａｎＭａｓｔｉｆｆ）属食肉目（Ｃａｒｎｉｖｏｒａ）犬科（Ｃａｎｉｄａｅ），是原产于青藏高原地区的古老犬种，也是中国唯一的一个大型犬种，属于国家二级保护动物。由于近几十年来藏獒被大量贩运到内地省份，甚至国外，加上当地生存环境恶化，青海、西藏等原产地优良藏獒数量剧减，正面临着种群资源流失的危险（郭宪等，２００８）。国内约２０年前才开始了对藏獒的认识与研究，主要研究集中在藏獒疾病防治、饲养管理、繁殖培育、品种鉴别等方面，少量研究涉及藏獒血液生理生化特征（李动等，２０００）、种群...

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