丙二醛对体外培养下小鼠骨髓间充质干细胞凋亡的影响

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丙二醛对体外培养下小鼠骨髓间充质干细胞凋

亡的影响

来源：学术堂作者：姚老师

发布于：2014-08-06 共3129 字

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有高度增殖和多谱系分化能力，与各种组织

的功能维持与修复再生有着密切的联系。但 MSC 可在体内外环境的影响下，出现增殖能力下

降，甚至发生凋亡等现象。在这些影响因素中，活性羰基类物质（reactive carbonyl

species，RCS ）对 MSCs 的生物学行为的影响尚未报道。RCS 主要由多不饱和脂肪酸过氧化，

在氧化应激条件下，其生成量显著增加.对组织功能和正常更新产生严重影响。

丙二醛（malondialdehyde，MDA）是一种代表性的 RCS 。本工作进行以小鼠骨髓 MSCs 的体

外培养，研究 MDA 对这种干细胞凋亡的影响，为全面认识 RCS 的病理生理作用提供实验证

据。

1 、材料与方法

1.1 材料

雌、雄性 Balb/c 小鼠各半，6~8 周龄，体重 20±1.5 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公

司，1，1，3，3- 四甲氧基丙烷（美国 Fluka 公司）；低糖 DMEM 培养基（美国 Gbico 公

司）；胎牛血清（美国 Hyclone 公司）；荧光定量 PCR 仪（7500 fastrealtime system, 美国 ABI

公司）；TRIzol 试剂（美国 Inritrogen 公司）；Taq man 逆转录酶试剂盒和 SYBR Green

MasterMix ( 美国 Applied Biosystems 公司；Anti-Bcl-2；Anti-Bax；Anti-Caspase-3 （美国 Santa

Cruz 生物公司）；Anti-actin （美国 Sigma 公司）；TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（美国 Roche

公司）。

1.2 MDA 的配制

将0.423 mL（2.5 mmol/L ）的 TMP 与1.0 mol/L 的HCl 2.0 mL 混合后，在 40 ℃的水浴中振荡

水解 2.5 min，TMP 完全水解后用 6.0 mol/L 的NaOH 调节 pH 值至 7.2 ，最后用 PBS 定溶到 50

mL ，并测定储备液在 267 nm（ε=31 500）的紫外吸收值来确定是否符合要求浓度。利用酸水

解1，1，3，3-四甲氧基丙烷（TMP ）法配置 50 mol/L 的MDA 储备液。

1.3 MSC 的体外培养

无菌条件下取小鼠双侧股骨胫骨，以 DMEM 培养液冲洗髓腔，获得骨髓细胞，制备骨髓单细

胞悬液。将骨髓有核细胞种于培养瓶中，接种密度为每 mm2 培养瓶底 5×106 个，培养体系为

含10% 胎牛血清的 DMEM ，于 37 ℃、10% CO2 、饱和湿度下培养。每 3 d 更换培养液，继续

培养, 细胞至铺满瓶底时，用胰蛋白酶消化法收集贴壁细胞,于同样培养体系和条件下传代培养,

以扩增和纯化骨髓 MSCs. 取传代培养 P3 代的 MSCs，实验组另加MDA （终浓度为

0、0.01、0.1、1.0 mmol/L ），培养 24 h 后，所有组更换培养基，继续培养 9 d。

1.4 流式细胞技术

细胞以 2×l03/cm2 细胞密度接种于细胞培养瓶中，每瓶 8 mL ，培养至 7 d，用胰蛋白酶将细胞

消化，取单细胞悬液 2×106 个细胞于 PBS（pH=7.2）缓冲液中，500 g 离心 5 min，弃上清，反

复两次，将单细胞悬液放置于 2～3 mL 冷70% 乙醇中，混匀，保存于4 ℃ ，至少30 min，离

心洗涤两次，加入PI，上机检测。

1.5 TUNEL 法

实验具体步骤参照 Roche 公司细胞凋亡试剂盒说明书, 结果分别用荧光显微镜观察。凋亡细胞

即TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end label－ing）阳性细胞，在荧光显微镜下呈黄绿色荧

光，非凋亡细胞无荧光显示。油镜下，每一组随机观察 500 个细胞，分别计数视野内TUNEL

阳性细胞和 TUNEL 阴性细胞。以凋亡细胞数与细胞总数的比率作为该标本的凋亡指数

（Apoptosis index，AI ），计算 4 组凋亡指数。

1.6 荧光定量 PCR

各组细胞经7 d 诱导培养后，RNA 的分离提取，按Trizol 试剂说明书进行。按Taq Man 试剂盒

要求，2 μg RNA 被逆转录成 cDNA 。用 SYBRGreen MaterMix 试剂检测待测的基因的 mRNA

水平，共重复检测 3 次。PCR 反应条件：95 ℃ 45 s,94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s, 72 ℃ 90 s, 35 个循

环, 72 ℃ 延伸 10 min。mRNA 水平用β-Actin 作内对照标化，基因的表达用△△Ct 法定量分

析。PCR 引物序列见表1。

1.7 Western 印迹分析

用冰冷的PBS 洗涤细胞 3 次，加细胞裂解液，在冰上将细胞迅速刮下，冰浴条件下超声破碎

细胞，离心后吸出上清液体，用 Bradford 方法进行蛋白质浓度测定，取提取的蛋白质样品（25

μg）加入等体积上样缓冲液，100 ℃ 煮5 min，10% SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳后电转移至

PVDF 膜上，封闭液室温封闭 1 h，1 1 000 ∶ 一抗4 ℃孵育过夜，TBST 洗涤3 次，1 2 000 ∶二

抗室温孵育 1 h，TBST 洗涤3 次，ECL 发光显影。条带进行图像分析，测定灰度值，用 β-

Actin 作内对照标化来表示各组 MSC 的Bcl-2、Bax、Caspase-3 相对表达量。

1.8 统计学处理

所有数据用平均值±标准差（x±s ）表示。多组间比较，采用方差分析；显著性水平为

P<0.05。Sigma Plot 计算机软件作图。

2 、结果

2.1 MDA 增加 TUNEL 阳性细胞百分率如图 1 所示，与对照组相比，0.1、1.0 mmol/LMDA 处

理组 TUNEL 阳性细胞百分率明显增加。0.01 mmol/L 组TUNEL 阳性细胞百分率，与对照组差

异无显著性。

2.2 MDA 增加 MSC 亚G1 峰凋亡细胞百分比流式细胞术结果显示，与对照组相比，MDA 处理

使得MSC 亚G1 峰凋亡细胞百分比增加。0.01、1.0 mmol/L MDA 处理作用更明显，呈一定的

剂量相关性（见图 2）。

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摘要：

丙二醛对体外培养下小鼠骨髓间充质干细胞凋亡的影响来源：学术堂作者：姚老师发布于：2014-08-06共3129字间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSCs）具有高度增殖和多谱系分化能力，与各种组织的功能维持与修复再生有着密切的联系。但MSC可在体内外环境的影响下，出现增殖能力下降，甚至发生凋亡等现象。在这些影响因素中，活性羰基类物质（reactivecarbonylspecies，RCS）对MSCs的生物学行为的影响尚未报道。RCS主要由多不饱和脂肪酸过氧化，在氧化应激条件下，其生成量显著增加.对组织功能和正常更新产生严重影响。丙二醛（malondialdehyde，MD...

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