SAMP8小鼠穹窿下器中部分核苷、蛋白质分布情况观察

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SAMP8 小鼠穹窿下器中部分核苷、蛋白质分

布情况观察

来源：学术堂作者：姚老师

发布于：2014-08-06 共3652 字

神经干细胞( neural stem cells,NSCs) 是分布于神经系统内的具有自我复制、增殖能力和多向分

化潜能的细胞群,能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等,是替代损伤神经细胞的潜

在内生性资源。近年来,Bennett 等在室周器官( circum-ventriculer organs,CVOs) 发现了神经干细

胞,穹窿下器( Subfornical organ,SFO) 作为一个较大的室周器官,缺乏血脑屏障,很多大分子都可以

通过,是脑神经再生和修复的重要位点之一。本研究利用免疫组化及免疫荧光双标法, 分别对

SAMP8 小鼠穹窿下器中溴脱氧尿嘧啶核苷( bromodeoxyuridine,Br-dU) 、性别决定基因高迁移

率组蛋白( sex determiningregion Y) ,SOX2 以及巢蛋白( Nestin) 阳性细胞分布进行观察。

材料和方法

1 、材料

SMP8 小鼠 20 只,8 月龄, 体重 18 ~ 22 g,雌雄不限,均为二级实验动物,由天津中医学院第一附属

医院实验动物中心提供( 清洁级,合格证号: W-J 津实动质 M 准字第 006 号) 。

2 、方法

2. 1 分组随机分为四组, 每组 5 只。一组按每只 50 J / K� � 溶于 0. 3 ml 生理盐水的剂量,腹腔

注射 Br-dU( 美国 SIGMA 公司) ,连续五天给药,每天两次, 间隔 8 h, 第六天进行 BrdU 免疫组织化

学染色。另外三组, 分别用于 SOX2、Nestin 免疫组化染色及 Nestin / SOX2 免疫荧光双标染色。

2. 2 实验流程

2. 2. 1 麻醉动物开胸经主动脉灌注 4% 多聚甲醛磷酸缓冲液( 0. 1 mol/L,pH 7. 2) ,灌注完毕,取出

整脑放入 4%多聚甲醛后固定过夜。用于免疫组化的标本,梯度酒精脱水、浸蜡、包埋,Leika 切

片机连续切片, 切片厚度 5 μm,并于显微镜下确定位置, 分别用于 BrdU、Nestin 和SOX2 免疫组

化染色; 用于免疫荧光双标的标本, 依次15%、30% 蔗糖溶液组织脱水,Leika 切片机连续冰冻切

片, 切片厚度 10 μm,显微镜下确定位置, 然后进行 SOX2/Nestin 免疫荧光双标染色。

2. 2. 2 免疫组织化学染色 ( 1) BrdU 免疫组织化学染色: 石蜡切片常规脱蜡至水,50% 甲酰胺抗原

修复液中微波修复 20 min,冷却后,2 × SSC 冲洗3 min× 2 次,0. 3% Trition 室温下15 min,2 mol / L

的盐酸中室温下30 min,0. 1 mol/L 的硼酸缓冲液 5 min,0. 05% 胰蛋白酶37℃ 下消化20

min。10% H2O2 封闭内源性过氧化物酶10 min,10% 山羊血清 37℃ 下封闭 30 min。加入一抗,小

鼠抗BrdU 单克隆抗体( 美国 SIGMA 公司) ( 1 100 ∶稀释) ,4℃冰箱孵育过夜。生物素标记山羊

抗小鼠 IgG,37℃ 温箱湿盒内孵育 30 min,辣根酶标记链霉卵白素工作液,37℃温箱湿盒内孵育 30

min。DAB 显色,苏木精溶液复染,常规酒精脱水、透明、封片,Olympus BX-UCB 显微照相系统

观察摄片。以上步骤除血清封闭后直接一抗外, 其余各步间用 0. 01 mol/LPBS( pH 7. 2 ~7. 4) 冲

洗5 min × 3 次。DAB 显色,苏木精溶液复染,常规酒精脱水、透明、封片,Olympus BX-UCB 显

微照相系统观察摄片。同时设阴性对照: 一抗加 0. 01 mol/LPBS( pH 7. 2 ~ 7. 4) ,其他步骤同前;

且以侧脑室室下区作为阳性对照; ( 2) Nestin 免疫组织化学染色:

石蜡切片常规脱蜡至水,柠檬酸缓冲液中微波修复 20 min,冷却后,10% H2O2 封闭内源性过氧化

物酶10 min,10% 山羊血清封闭 37℃ 下封闭 30 min。加入一抗, 单克隆小鼠抗Nestin 抗体( 美国

SIGMA 公司) ( 1 50 ∶稀释) , 剩余操作方法同BrdU 免疫组化染色; ( 3) SOX2 免疫组织化学染

色: 除一抗为多克隆山羊抗 SOX2 抗体( 美国 SIGMA 公司) ( 1 700 ∶稀释) 外, 其他操作方法同

Nestin 免疫组化染色。

2. 2. 3 免疫荧光双标染色冰冻切片依次浸入 0. 01 mol / L PBS( pH 7. 2 ~ 7. 4) 10 min、0. 3%

TritonX-100 中15 min, 然后10% 山羊血清 37℃ 下封闭 30min。加入一抗, 鼠抗Nestin 单克隆抗

体( 1 50 ∶稀释) 及山羊抗 SOX2 多克隆抗体( 1 500 ∶稀释) ,4℃冰箱孵育过夜。避光加入二

抗: FITC 标记鸡抗小鼠 IgG 荧光抗体( 1 50) ∶稀释,罗丹明兔抗山羊荧光抗体( 1 500 ∶稀

释) ,37℃ 温箱湿盒内孵育 2 h, 室温孵育 30 min。以上步骤除血清封闭后直接一抗外,其余各步间

用0. 01 mol/L PBS( pH 7. 2 ~ 7. 4) 冲洗5min × 3 次,加入荧光二抗后要避光冲洗。50% 甘油封

固,Olympus BX-UCB 显微照相系统观察摄片。

2. 3 阳性细胞计数 BrdU 阳性表达细胞的细胞核呈棕褐色,阴性细胞细胞核为蓝色。SOX2 阳性

细胞的细胞核呈棕褐色,阴性细胞细胞核为蓝色。Nestin 阳性细胞的细胞浆为棕褐色,阴性细胞

的胞浆无染色。

结果

1 BrdU、SOX2 及Nestin 阳性细胞在穹窿下器的分布 1. 1 BrdU 组织化学染色在 SMP8 小鼠穹

窿下器连续切片上,BrdU 阳性标记细胞的胞核呈棕褐色或棕黑色,着色不均匀,深浅不一。阳性标

记细胞有的散在分布,有的成对分布,细胞核较小,有的呈椭圆形,有的形状不规则( Fig. 1A) 。

1. 2 SOX2 组织化学染色 SOX2 阳性细胞的胞核染色深浅不一,呈棕色或棕褐色,在室管膜区和大

血管周围分布密集,其他部位散在分布。高倍镜下可见阳性细胞胞核多呈圆形或椭圆形,细胞核

长2. 5~ 5. 5 μm, 宽1. 8 ~ 4. 0 μm( Fig. 1B)。

1. 3 Nestin 组织化学染色 Nestin 阳性表达细胞的胞浆为棕色或棕褐色,大小不一,有多个数目不等

的分支,细长的突起相互交织,呈絮状或丝状,在室管膜下区分布密集,背侧区分布较少,在两侧大血

管周围呈放射状分布。高倍镜下可见到粗大的阳性颗粒,放射丝长 11 ~45 μm,宽0.6 ~1.5

μm( Fig.1C) 。

2 SOX2、Nestin 阳性标记细胞在穹窿下器的分布 SOX2 阳性细胞胞核为红色,在室管膜区密集

表达,其他部位散在分布,胞核大小不一,形状不等,在室管膜区排列整齐, 胞核长1 ~5 μm, 宽1 ~3. 5

μm( Fig. 2A) 。Nestin 阳性表达细胞为绿色,呈丝絮状或云片状分布,彼此交织, 丝状结构长 15 ~

35 μm,在室管膜下区和中央区分布密集,联合成片状( Fig. 2B) 。穹窿下器内可见散在的

SOX2/Nestin 双阳性细胞( Fig. 2C) 。

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摘要：

SAMP8小鼠穹窿下器中部分核苷、蛋白质分布情况观察来源：学术堂作者：姚老师发布于：2014-08-06共3652字神经干细胞(neuralstemcells,NSCs)是分布于神经系统内的具有自我复制、增殖能力和多向分化潜能的细胞群,能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等,是替代损伤神经细胞的潜在内生性资源。近年来,Bennett等在室周器官(circum-ventriculerorgans,CVOs)发现了神经干细胞,穹窿下器(Subfornicalorgan,SFO)作为一个较大的室周器官,缺乏血脑屏障,很多大分子都可以通过,是脑神经再生和复的重要位点之一。本研究利用免疫组化及免疫...

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