IL-18对hBMSC成骨分化的重要性探析

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IL-18 对hBMSC 成骨分化的重要性探析

来源：山东医药作者：倪飞飞,徐庆,王亚辉,

发布于：2021-06-15 共6747 字

　　摘　　　　　要：目的探讨 IL-18 对人骨髓间充质干细胞（hBMSC ）的成骨分化作用。方法取

生长良好的第 3代hBMSC 每孔 2×104 个接种于 6孔培养板，并随机分成两组。于细胞汇合率

为80%～90%时，对照组采用经典成骨诱导液培养，观察组采用经典成骨诱导液+质量浓度为

100 ng/m L 的重组人 IL-18 培养液培养。成骨分化诱导 1、3、7 d 后检测骨特异性转录因子-

2(Runx2)、骨形态发生蛋白-2(BMP2)、骨桥蛋白（OPN）mRNA 及蛋白表达。两组 hBMSC 诱

导分化 7 d 后进行碱性磷酸酶（ALP ）染色、茜素红染色。结果两组成骨诱导 1、3、7

d,Runx2、BMP2、OPN mRNA 及蛋白表达比较差异有统计学意义（P均<0.05）。观察组随诱

导时间延长，Runx2、BMP2、OPN m RNA 及蛋白表达增加，不同时点 Runx2、BMP2、OPN

mRNA 及蛋白表达差异有统计学意义（P均<0.05）。观察组成骨诱导 7 d 后ALP 染色较对照组

明显深染，茜素红染色矿化结节染色区域明显多于对照组。结论 IL-18 体外能促进 h BMSC 向

成骨细胞分化。

　　　　　关键词 :　　骨髓间充质干细胞; IL-18;骨特异性转录因子-2;骨形态发生蛋白-2;骨桥蛋白;成骨

作用;

　　 Abstract： Objective To explore the effect of IL-18 on osteogenic differentiation of human

bone marrow mesenchymal stem cells(hBMSC).Methods The well-growing third-generation hBMSCs

were inoculated into 6-well culture plate with 2×104 per well and then were randomly pided into two

groups.When the cell confluence rate was 80%-90%,the cells in the control group were cultured with

classical osteogenic induction liquid,and the cells in the observation group with classical osteogenic

induction liquid+recombinant human IL-18 culture medium with a mass concentration of 100

ng/mL.The bone-specific transcription factor-2(Runx2),bone morphogenetic protein-2(BMP2),and

osteopontin(OPN)mRNA and protein expression levels were detected at 1,3,and 7 days after

osteogenic differentiation induction.The hBMSCs of the two groups were stained with alkaline

phosphatase and alizarin red for 7 days after induction of differentiation.Results There were

statistically significant differences in the mRNA and protein expression levels of Runx2,BMP2,and

OPN between the two groups at 1,3,and 7 days after induction of differentiation(all P<0.05).In the

observation group,over the time of induction,the expression levels of Runx2,BMP2,and OPN mRNA

and protein increased,and the differences in Runx2,BMP2,and OPN mRNA and protein expression

levels at different time points were statistically significant(all P<0.05).It was observed that at 7 days

after osteoinduction,ALP staining was significantly darker in the observation than in the control

group,and the staining area of mineralized nodules in alizarin red staining was significantly larger than

that of the control group.Conclusion IL-18 can promote the differentiation of hBMSC into osteoblasts

in vitro.

　　 Keyword： bone marrow mesenchymal stem cells; interleukin-18; bone-specific transcription

factor-2; bone morphogenetic protein-2; osteopontin; osteogenesis;

随着当今社会经济和交通运输业的快速发展，多发性骨折合并脑、肺、腹腔脏器损伤患者有增

加趋势，临床治疗面临很多挑战。脾破裂合并肢体骨折是临床常见的高能量多发伤，全脾切除

是其首要急救措施。本课题组前期研究发现，复合外伤骨折合并脾破裂而行脾切除的患者中骨

折愈合明显延迟，考虑与脾切除后机体免疫炎性功能改变导致与骨折愈合相关的炎性因子明显

减少进而影响骨折愈合有关[1,2]。IL-18 属于 IL-1 家族，是前炎症细胞因子之一。研究显示 IL-

18 在骨缺损修复过程中起重要作用，对骨髓间充质干细胞（BMSC）、成骨细胞，破骨细胞均

有影响，但具体机制尚不明郎[3,4]。IL-18 主要由巨噬细胞产生，而脾脏是机体细胞免疫和体

液免疫的中心，内含丰富巨噬细胞、淋巴细胞及炎性因子同时能高效表达 IL-18，这些免疫细

胞及炎性因子与机体损伤修复密切相关[5,6]。研究表明，骨折后 BM-SC 会首先募集到骨折

处，第一时间参与骨折修复；骨折后 BMSC 所处的骨折微环境对细胞分化及功能发挥起着重要

调节作用，骨损伤后骨折断端局部为血肿炎性微环境[7]，炎性细胞因子对 BMSC 成骨分化可

能存在促进或抑制作用。因此有必要进一步探究细胞因子 IL-18 对BMSC 成骨分化的影响。

　　 1　、材料与方法

　　 1.1 　、主要材料

人骨髓间充质干细胞（hBMSC，中国医科大学盛京医院干细胞研究中心提供）、重组人 IL-

18（美国 R&D 公司）、DMEM-F12 培养基（美国 Hyclone）、胎牛血清（无锡依科赛）、青

霉素、链霉素（大连美伦）、胰蛋白酶（美国 Gibco）、地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸

（美国 Sigma 公司）、茜素红 S（碧云天公司）、碱性磷酸酶（ALP）染色试剂盒（碧云天公

司）、特异性转录因子-2(Runx2）一抗（Proteintech 公司）、骨形态发生蛋白-2(BMP2）一抗

（Proteintech 公司）、骨桥蛋白（OPN）一抗（Proteintech 公司）、GAPDH 一抗（Proteintech

公司）、兔二抗（北京中杉金桥）、PCR 引物、PCR 试剂盒、DEPC 水和Trizol 试剂均购于

Takara 公司；高速低温离心机和 CO2 培养箱（美国赛默飞公司）、倒置相差显微镜+图像采集

系统（Nikon,Eclipse NI）、荧光定量PCR 仪（美国 Life technologies,ABI7500 Fast），一次性

25 cm2 细胞培养瓶、6孔培养板、离心管等细胞培养相关耗材（无锡 Nest 公司）、细胞破碎仪

（美国 Next advance,BBY24M）。

1.2　、hBMSC 培养

取原代hBMSC 置于DMEM-F12 生长培养液（含 89%F12-DMEM、15%FBS、1%青-链霉

素），放于37℃、5%CO2，培养箱内培养 24 h 后进行首次换液弃除非贴壁细胞，之后每隔48

h进行 1次换液，当细胞贴壁大约 90%时进行传代，选用长势良好的第 3代细胞进行相关实

验。

　 1.3　、经典成骨诱导液的配制

在上述 DMEM-F12 生长培养液基础上配制成骨诱导液，终浓度分别为：地塞米松 1×10-

8mol/L、β-甘油磷酸钠3.3 mmol/L、维生素 C 16.67 mg/L。无菌条件下用DMEM-F12 生长培养

液定容至 100 mL，充分混匀，4℃保存。

　 1.4 　、hBMSCs 分组

取生长良好的第 3代hBMSC 每孔 2×104 个接种于 6孔培养板，并随机分成两组。于细胞汇合

率为 80%～90%时，对照组采用经典成骨诱导液培养，观察组采用经典成骨诱导液+质量浓度

为100 ng/mL 的重组人 IL-18 培养液培养；每孔 2 mL，每 48 h 更换 1次培养液。

1.5 　、Runx2、BMP2、OPN　mRNA 表达检测

两组分别继续培养 1、3、7 d 后收集细胞，用 Trizol 充分裂解细胞提取总RNA。PCR 反应条

件：94℃预变性 10min,95℃变性 15 s,60℃退火 10 s,72℃延伸30s，共 40 个周期。选用

Runx2、BMP2、OPN 相应引物序列，人 β-actin 作为内参，采用实时荧光定量PCR 法检测

Runx2、BMP2、OPN mRNA 表达。

　 1.6 　、Runx2、BMP2、OPN 蛋白表达检测

两组分别继续培养 1、3、7 d 后收集细胞，提取蛋白。SDS-PAGE 凝胶电泳：80 V 30 min,120

V 70 min。200mA 70 min 将凝胶中蛋白转膜至 PVDF 膜上，5%脱脂牛奶封闭 1.5 h。TBST 洗

膜，一抗孵育 4℃过夜。第 2日，常温下二抗孵育 2 h。然后PVDF 膜用TBST 洗3次，每次10

min,ECL 曝光。采用 Western blotting 法检测 Runx2、BMP2、OPN 蛋白表达，GAPDH 作为内

参。

　 1.7 　、ALP 染色

两组细胞经成骨诱导培养 7 d 后弃培养液，4%的多聚甲醛 1 mL 固定 15 min，加入DDH2O 1

mL，轻柔冲洗 3次。按照BCIP/NBT ALP 显色试剂盒说明书配制ALP 染色剂染色，室温避光

孵育 6 h 后，轻轻吸去染色试剂，使用DDH2O 终止显色反应，在 40 倍显微镜下观察并拍照。

1.8 　、钙结节茜素红染色

两组细胞经成骨诱导培养 7 d 后进分别用PBS 冲洗 3次，4%多聚甲醛固定 1 min，各组加入

DDH2O 1 mL，轻柔冲洗 3次。1%茜素红染液（pH 4.2）染色，37℃孵育 0.5～1 h，倒掉茜素

红染液，DDH2O 加入终止反应。在 40 倍光镜下观察成骨细胞矿化结节形成情况。

1.9 　、统计学方法

采用 SPSS17.0 统计软件进行处理分析。计量资料符合正态分布采用表示，组间比较采用重复

测量的方差分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 　、结果

　　 2.1 　、hBMSC 生长情况

原代hBMSC 接种后约2 h 细胞迅速贴壁、伸展恢复成梭形，细胞均匀生长，原代细胞培养 4 d

后即可进行传代，以后平均4～5 d 传代1次，传至第3代时，细胞生长良好呈均一梭形，形态

清楚。相差倒置显微镜下观察第 3代hBMSC 呈长梭形或多角形生长，类似成纤维细胞，细胞

体丰满，细胞质均匀。

　 2.2 　、两组 Runx2、BMP2、OPN　mRNA 表达

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IL-18对hBMSC成骨分化的重要性探析来源：山东医药作者：倪飞飞,徐庆,王亚辉,发布于：2021-06-15共6747字　　摘　　　　　要：目的探讨IL-18对人骨髓间充质干细胞（hBMSC）的成骨分化作用。方法取生长良好的第3代hBMSC每孔2×104个接种于6孔培养板，并随机分成两组。于细胞汇合率为80%～90%时，对照组采用经典成骨诱导液培养，观察组采用经典成骨诱导液+质量浓度为100ng/mL的重组人IL-18培养液培养。成骨分化诱导1、3、7d后检测骨特异性转录因子-2(Runx2)、骨形态发生蛋白-2(BMP2)、骨桥蛋白（OPN）mRNA及蛋白表达。两组hBMSC诱导分化7d...

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