BMP2及GDNF对体外培养肠神经嵴干细胞增殖、迁移的影响
BMP2 及GDNF 对体外培养肠神经嵴干细胞增
殖、迁移的影响
来源：学术堂 作者：周老师
发布于：2014-11-07 共6151 字
肠神经嵴干细胞(enteric neural crest stem cells,ENCSCs)来源于迷走神经嵴(vagal crest,VC)和骶神
经嵴(sacral crest,SC).VC 来源的 ENCSCs 定植于整个消化道,构成肠神经系统的绝大部分肠神经
节.该过程发生障碍,将造成肠道不同部位缺乏神经节细胞,局部肠管痉挛和狭窄,近端肠管代偿扩
大,从而导致先天性巨结肠的发生[1].先天性巨结肠的发病率高达 1 /5 000 ~ 1 /2 000,是严重影响
儿童健康的先天性疾病.神经嵴干细胞迁徙的启动需骨形态发生蛋白(bone morphogenetic
proteins,BMPs)的参与[2].研究发现, 胶质细胞源性神经营养因子 (glial cell line-derived
neurotrophic factor,GDNF) 与受体 RET 结合可激活存活的信号通路, 而GDNF 缺失会诱导细胞凋
亡[3]. 目前骨形态发生蛋白 2 (bone morphogeneticprotein 2,BMP2) 、GDNF 在ENCSCs 增殖及迁
移中的作用尚无定论. 本研究采用机械分离法和酶消化法从胎鼠肠道组织获取 ENCSCs,使用免
疫荧光技术对其干细胞特性和多向分化能力进行鉴定, 探讨 BMP2 及GDNF 对体外培养
ENCSCs 增殖、迁移的影响,阐明 BMP 信号通路在先天性巨结肠发生、发展过程中可能参与的
分子机制,旨在为先天性巨结肠的病因诊断及治疗提供实验室依据.
1 材料与方法
1. 1 试验动物
孕13. 5 d 清洁级 SD 大鼠共 20 只(体质量 220 ~250 g),由重庆医科大学实验动物中心[许可证
号:SCXK(渝) 2007-0001]提供.
1. 2 仪器与试剂
细胞培养主要仪器:ESPEC 恒温 CO2 培养箱和 Olympus 倒置显微镜.DMEM/F12 完全培养基
(Sigma 公司)组成:B27 添加剂、N2 添加剂、重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长
因子(EGF,Abcam 公司),青霉素和链霉素(华北制药).
促分化培养基组成:DMEM/F12 完全培养基添加 10% (体积比)胎牛血清.其他: Ⅳ胰蛋白酶、 型胶
原酶、左旋多聚赖氨酸(Sigma 公司) .一抗: 兔抗鼠NGFRp75 、兔抗 Nestin 多克隆抗体、兔抗
GFAP 、兔抗 SMAα 、兔抗 TUJ1(Abcam 公司),FITC 标记抗鼠CD49d、PE 标记抗鼠
P75(Biolegend 公司),细胞因子 BMP2、GDNF( PeproTech 公司) .
1. 3 方法
1. 3. 1 细胞分离培养 取孕 13. 5 d SD 大鼠腹腔注射 10% 水合氯醛 15 mL/kg,麻醉显效后常规消
毒剖腹取胎鼠.解剖显微镜下取出胎鼠肠道组织,小心去掉肠管浆膜层及周围结缔组织,然后将剩
余部分尽可能剪碎.0. 25% 胰酶与 1. 0 mg/mL 胶原酶分别在37 ℃恒温摇床中消化 10 min 和20
min,400 目筛网过滤,1 000 r/min 离心 5 min.取沉淀,DMEM/F12 重悬,制成单细胞悬液.1 000 r/min
离心 5 min,弃去上清.沉淀中加入ENCSCs 培养基重悬,吹打均匀,细胞计数并调整细胞密度(1 ~2)
× 106/ mL 接种到纤维素(2μg/cm2)预包被的一次性培养瓶中,37 ℃,5% CO2 孵箱培养. 每隔 2 d 半
量换液 1 次. 细胞培养第1 天开始,每天定时于光学显微镜下观察所培养细胞形态变化并拍照.
1. 3. 2 ENCSCs 鉴定 采用免疫荧光法对传代培养的干细胞进行 P75、Nestin、TUJ1、GFAP、α-
SMA 标记染色,对所获得细胞的干性及多向分化能力进行鉴定.
1. 4 BMP2、GDNF 对原代培养 ENCSCs 的调控作用
1. 4. 1 BMP2 对ENCSCs 增殖能力的影响 获得的ENCSCs 分散后调整细胞数为(1 ~ 2) × 106/
mL, 分别接种于含不同浓度细胞因子 BMP2(10 ~ 120 ng/mL)培养基中,37 ℃,5% CO2 孵箱中培
养, 每隔 1 d 半量换液 1 次, 培养 1 周后,计数不同处理组细胞成球率[4], 观察不同浓度 BMP2 对
ENCSCs 增殖能力的影响.
成球率= (细胞球数/接种细胞数) ×100%1. 4. 2 GDNF 与BMP2 对ENCSCs 增殖能力的影响 获
得的ENCSCs 分散后调整细胞数为(1 ~2) ×106/ mL, 根据是否加入细胞因子 BMP2 和/ 或GDNF
分组:对照组(ENCSCs 单独培养组)、ENCSCs + GDNF 100 ng/mL 组、ENCSCs + BMP2 50
ng/mL 组、ENCSCs +BMP2 50 ng/mL + GDNF 100 ng/mL 组. 不同处理组细胞于 37 ℃,5% CO2
孵箱中培养, 每隔 1 d 半量换液 1 次, 于培养第2、4、6 天分别收集细胞,计数不同处理组干细胞
成球率, 观察不同处理组ENCSCs 增殖能力的影响, 每组重复3 次.
1. 4. 3 GDNF 与BMP2 对ENCSCs 迁移能力的影响 根据Hotta 等[5] 研究 ENCSCs 迁移的方法并
进行改良.取交媾后 13. 5 d 胎鼠中肠肠片200 ~ 300 μm,包埋于含预先配置好的三维立体培养基
的24 孔板中( 每孔含鼠尾胶10 mg,0. 2%冰醋酸 2. 5 mL,0. 8 mol/L 碳酸氢钠 100μL,200 mmol/L
氢氧化钠70 μL,DMEM/F12 7.3 mL). 根据是否加入细胞因子 BMP2 或/ 和GDNF 分组:对照组(肠
片单独培养) 、肠片+ GDNF 100 ng/mL 组、肠片+ BMP2 50 ng/mL 组、肠片+ BMP2 50 ng/mL
+ GDNF100 ng / mL 组, 不同处理组于 37 ℃ ,5% CO2 孵箱内培养 72 h 后,计数迁移的细胞数,研
究ENCSCs 的迁移能力.
1. 5 统计学分析
数据以x ± s 表示, 采用 SPSS 11. 0 统计软件进行 t 检验.
2 结果
2. 1 原代培养 ENCSCs 形态学观察及鉴定 2. 1. 1 原代培养 ENCSCs 形态学观察 原代培养 1 d 时,
可见大小、形态不一的贴壁细胞及细胞碎片( 图1A).原代培养 2 d 时,瓶底可见部分细胞互相聚
集,形成类球状的细胞团块,并且有长的突起向周围延伸(图1B).原代培养 3 d 时,细胞球样物体积
逐步增大,而且遮光性增加,细胞球之间形成交互的联接( 图1C). 第4 ~ 5 天,贴壁细胞开始离开瓶
底悬浮生长,形成神经球样体( 图1D). 第7 ~8 天,神经球形成,体积变大,悬浮生长( 图1E).继续培养
可见神经球发出突起"锚"定在培养瓶底部,出现神经网络,与周围细胞形成交互的网络联接( 图
1F).
2. 1. 2 原代培养 ENCSCs 干性及多向分化能力鉴定 取传代培养后8 d 形成的神经球进行 P75 和
Nestin 免疫荧光双标染色. 结果显示神经球整个球体均充满 P75 和Nestin 的荧光共表达,提示所
获得的神经球内含大量 ENCSCs. 另取传代培养后8 d 形成的神经球加入分化培养基中,分化培养
3 d,见神经球贴壁生长,神经球逐渐消失,大量细胞从神经球内迁出,免疫荧光对细胞进行染色( 图
2), 显示ENCSCs 可以分化为神经元(TUJ1+)、神经胶质细胞(GFAP+)、平滑肌细胞(α-SMA+),提
示原代培养的 ENCSCs 具有多向分化能力.
2. 2 BMP2 对原代培养 ENCSCs 生物学行为的影响 2. 2. 1 BMP2 对ENCSCs 成球率的影响 在 低
浓度下,ENCSCs 成球能力对 BMP2 具有浓度依赖性.随浓度增加(10 ~80 ng / mL),ENCSCs 成球
能力逐步增强, 但在高浓度 ( 80 ~120 ng / mL) 下,BMP2 不能无限促进 ENCSCs 成球能力( 图3),
表明 BMP2 对ENCSCs 成球率影响在低浓度时具有浓度依赖性,高浓度时无明显差异.
2. 2. 2 BMP2 及GDNF 对ENCSCs 增殖能力的影响 正常培养情况下,ENCSCs 增殖缓慢,BMP2
或GDNF 单独应用均能促进 ENCSCs 的增殖能力(P < 0. 05),两者联合应用时,对ENCSCs 的增殖
摘要：
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BMP2及GDNF对体外培养肠神经嵴干细胞增殖、迁移的影响来源：学术堂作者：周老师发布于：2014-11-07共6151字肠神经嵴干细胞(entericneuralcreststemcells,ENCSCs)来源于迷走神经嵴(vagalcrest,VC)和骶神经嵴(sacralcrest,SC).VC来源的ENCSCs定植于整个消化道,构成肠神经系统的绝大部分肠神经节.该过程发生障碍,将造成肠道不同部位缺乏神经节细胞,局部肠管痉挛和狭窄,近端肠管代偿扩大,从而导致先天性巨结肠的发生[1].先天性巨结肠的发病率高达1/5000~1/2000,是严重影响儿童健康的先天性疾病.神经嵴干细胞迁徙的启动...
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作者：闻远设计
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时间：2024-07-13
