论细胞培养无菌技术及污染控制措施

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论细胞培养无菌技术及污染控制措施

来源：实验与检验医学作者：周梦怡;勇强

发布于：2020-04-23 共4476 字

　　细胞培养论文（专业范文 8篇）之第七篇

　　摘要：细胞培养技术是分子生物学研究中的重要手段,现已广泛应用于生物学、医学等多

个领域。而无菌技术又是细胞培养技术中的关键性技术。简要地介绍细胞培养时常见的污染物,

并结合在实际工作中总结出来的经验,着重讨论污染途径及对应的有效控制措施,为细胞培养操

作者提供参考。

　　关键词：细胞培养,无菌技术,污染

为了避开正常体内自体调节以及实验应激所可能产生的机体整体因素的影响,在20 世纪初,出现

———了一种研究动物细胞的方法组织培养[1]。组织培养包括了器官培养和细胞培养。特别是

细胞培养,自20 世纪后半叶开始,在生物学、医学等多个领域,发挥出了日益重要的作用[2,3]。

细胞培养是指经酶的、机械的或化学的方法将组织或原代外植块的细胞分散开来,使呈细胞悬

液,然后将其培养于固体基质上贴壁生长,或使其在培养基中悬浮生长[4]。由于细胞是在模拟体

内生理环境等特定的体外条件下进行生长,缺乏机体的免疫系统等机制,因此细胞培养工作除了

需要完善的实验设计和技术方法外,成败的关键还在于能否保持无菌状态、战胜多种来源污染的

挑战。这就要求细胞培养操作者不仅要清楚细胞培养时潜在的污染物,还要掌握对应的控制措

施。

1　污染物[5,6,7]

细胞培养时可能的主要污染源有三类:化学污染、细胞交叉污染和微生物污染。化学污染在细

胞培养过程中发生率低。同一时期内进行多种细胞培养时可能会出现细胞交叉污染的情况,造成

培养的细胞不纯。微生物则是细胞培养时最常见的污染物。如何有效的控制微生物污染,是细胞

培养的重要问题。造成细胞污染的常见微生物种类有细菌、真菌和支原体。

1.1 细菌污染

细菌是一种原核细胞微生物,常见的细菌污染主要由大肠埃希菌、枯草杆菌、假单胞菌、葡萄球

菌等引起。通常在发生细菌污染后,培养基会变浑浊,p H 会变低,细胞的生长被抑制,甚至死亡。

在10×物镜下可观察到细胞间的空隙有点状颗粒。

1.2 真菌污染

真菌是一种真核细胞微生物,个体比细菌大。污染培养细胞的多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢

子霉、白念珠菌、酵母菌等。被真菌污染后,培养基 p H 会发生改变,表面可出现肉眼可见的、

白色或浅黄色漂浮物。在光学显微镜下可观察到细胞间有纵横交错的丝状或树枝状菌丝。被酵

母菌污染后,培养液亦会发生浑浊,但p H 变化不大,酵母菌呈独立的圆形或卵形颗粒,分散在细胞

周围生长。被念珠菌污染的培养液则依然清亮,念珠菌呈链状生长。真菌喜温暖潮湿的环境,故

细胞培养箱、水浴锅等系统都是真菌生长的温床,是潜在的污染途径。

1.3 支原体污染

支原体,曾被称为类胸膜肺炎微生物,是为目前发现的最小、最简单的原核生物。支原体没有固

定的形态,多呈球形。支原体没有细胞壁,通过吸取宿主的营养物和甾醇类物质进行生长和维持

细胞形态。支原体污染是一个困扰大多数实验室的问题。支原体的大小为0.1~0.3μm,光学显微

镜下不易观察到,可穿过绝大部分的滤膜,并且因其没有细胞壁,作用于细胞壁的抗生素对它无

效。支原体生长缓慢,培养基无特殊的外在表现,但它对宿主细胞的表达、功能、生长、胞内细

胞器、代谢等方面都会产生深远影响[8]。在培养过程中若发现细胞增殖减慢、饱和密度下降或

发生破碎时,可怀疑是支原体的污染。

　　 2　污染途径及对应的控制措施

细胞一旦发生污染,不仅影响实验结果,而且浪费人力、物力和时间。保持无菌,无论对于新人还

是老手,都是一个巨大的挑战。体外培养的细胞缺乏免疫系统,自体不能清除污染物,因此控制污

染的最佳方式就是预防污染。

结合文献报道[4,9,10,11,12,13]和本人的实际经验认为,在细胞培养过程中,潜在的污染途径主要

包括操作技术和环境,其中环境因素又包括了无菌试剂和材料、层流超净工作台、恒温恒湿培养

箱、水浴锅和冰箱等。

2.1 操作技术

如果培养环境洁净,那么污染会因操作者的技术问题而出现。

2.1.1 培养操作前

⑴个人卫生:进入细胞培养室时应更换实验室专用鞋或者穿鞋套;穿戴实验服、口罩和手套,用消

毒酒精(75%浓度的乙醇)擦拭双手;如果操作者是长发,应扎于脑后。⑵工作台准备:提前0.5~1h

打开超净台的紫外灯进行消毒;用蘸有消毒酒精的纸巾擦拭超净台的台面、挡板等。⑶试剂准

备:从冷藏室或冷冻室取出所需的培养基等试剂,于37°C 水浴锅中进行加热;加热后用消毒酒精擦

拭瓶身,并立马放入超净工作台内。须注意的事项有:外套、书包等物品,易附着丰富的微生物,不

应带入细胞房。

2.1.2 培养操作中

⑴台面布置:按实验需要和个人习惯,合理放置试剂、耗材、仪器等物品;点燃酒精灯后开始实验

操作。⑵操作:靠近火焰进行实验操作;试剂瓶经火焰旋转灼烧后打开;挑选吸管,快速的纵向在火

焰上来回移动并做180°旋转;将试剂瓶向吸管倾斜,吸出所需的液体量;灼烧瓶颈后,重新盖上盖

子;等所有操作完毕后,拧紧瓶盖。

须注意的事项有:操作要准确、敏捷、有序;吸取溶液时,应专管专用,避免交叉污染;吸管管口要

向下倾斜,以防止液体倒流进入移液器内发生污染;尽量减少细胞和培养基的敞口时间;已开口的

试剂瓶尽可能的倾斜放置,防止下落微生物的污染;避免在敞口的细胞培养皿及培养皿盖上方操

作;不要面对工作台或细胞培养箱讲话或咳嗽,防止口腔微生物随唾沫飞入而发生污染;若发生外

溢,用蘸有消毒酒精的棉球及时擦去。

2.1.3 培养操作后

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摘要：

论细胞培养无菌技术及污染控制措施来源：实验与检验医学作者：周梦怡;勇强发布于：2020-04-23共4476字　　细胞培养论文（专业范文8篇）之第七篇　　摘要：细胞培养技术是分子生物学研究中的重要手段,现已广泛应用于生物学、医学等多个领域。而无菌技术又是细胞培养技术中的关键性技术。简要地介绍细胞培养时常见的污染物,并结合在实际工作中总结出来的经验,着重讨论污染途径及对应的有效控制措施,为细胞培养操作者提供参考。　　关键词：细胞培养,无菌技术,污染为了避开正常体内自体调节以及实验应激所可能产生的机体整体因素的影响,在20世纪初,出现———了一种研究动物细胞的方法组织培养[1]。组织培养包括了器官...

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