慢病毒转染破骨样细胞的可行性分析

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慢病毒转染破骨样细胞的可行性分析

来源：学术堂作者：朱老师

发布于：2016-11-17 共4075 字

骨代谢的平衡由骨形成和骨吸收维持，成骨细胞（OB ）和破骨细胞（OC ）起着重要作用。其

中，OC 是一种具有独特骨吸收功能的多核巨细胞，来源于造血细胞系，属于终末细胞，不能

增殖和传代〔1〕。而破骨样细胞（OLC ）是指具有 OC 性质，通过原代培养或实验诱导生成

的，用于实验研究的细胞。到目前为止，还没有成熟的 OC 株。自从 Testa 等〔2〕首次在体外

培养骨髓造血细胞时发现能够形成 OC 后，骨髓诱导培养法分化 OLC 的技术形成并逐渐开展应

用。获得 OC 的方法多种多样，包括诱导培养、直接培养等技术都逐渐趋于稳定成熟，有助于

着手从基因水平深入研究骨吸收的机制，从而进一步开发代谢性骨病的治疗药物。本文拟证实

慢病毒转染 OLC 的可行性，为进一步利用 OLC 进行基因学研究奠定重要基础。

1 材料与方法

1. 1 实验动物 4周龄雌性 SD 大鼠，购自吴氏实验动物中心。

1. 2 主要试剂、材料和仪器低糖 DMEM 培养基（美国 Hy-clone 公司） ,中美胎牛血清

（Bioind ）, 红细胞裂解液，双抗、磷酸盐缓冲液（PBS,美国 Gibco 公司） ,鼠M-

CSF、RANKL （美国Peprotech 公司） ,抗酯酸性蛋白酶染色试剂盒（TRAP,美国 Sig-ma 公

司） ,NFAT 抑制剂（德国 Calbiochem 公司） ,Trizol （美国 Ambion 公司） ,逆转录试剂盒

（Ta KaRa ）,SYBR Green 试剂（In-vitrogen ）,NFAT2RNAi 慢病毒、对照病毒由厦门欣基公

司包装合成，引物由上海生工公司合成；10 cm 培养皿、六孔板（美国 Corning 公司） ;CO2 培

养箱（美国 Thermo 公司） ,DM2500 荧光显微镜（德国 Leica 公司） ,PCR 扩增仪（美国 Bio-

Rad 公司） ,荧光定量 PCR 仪7500 型（美国 ABI 公司）。

1. 3 大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs ）的分离与诱导培养取 SD 大鼠麻醉后处死，无菌条件下

取双侧股骨和胫骨，剔除多余软组织，用 5 ml 注射器吸取适量低糖 DMEM 冲洗骨髓腔，直至

骨髓腔变白，取冲洗液充分吹打制成细胞悬液后离心，800 r / min,3 min.弃上清加红

细胞裂解液，混匀静置 2 min,800 r / min 离心 3 min,弃上清去除红细胞，得到白细胞沉淀。重悬

于含25. 0 ng/ml M-CSF +50. 0 ng/ml RANKL 的低糖 DMEM 完全培养液（含10% FBS、1%青

霉素与链霉素）,接种于 10 cm 培养皿，37℃ 、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养 24 h.取未贴

壁细胞，调整细胞密度为2. 5×105 重悬于含25. 0 ng/ml M-CSF +50. 0 ng / ml RANKL （大鼠）

的低糖 DMEM 完全培养液，接种于六孔培养板，继续培养，首次半定量换液，以后每隔 3 d 换

液。

1. 4 慢病毒转染 OLC 并分组以hela 细胞（2. 5 ×104/ 孔）对比，待获得的 OLC 生长融合达约

60% 时，对照病毒（无 NFAT2 沉默）转染按感染复数（MOI）15、5、1各分为三组，18 h 后

首次换液，此后每2 ~ 3 d 换液1次并于第5天观察荧光表达情况，荧光显微镜（×200 ）下随

机选取5个视野拍摄 OLC 和hela 细胞，并用 Image-Pro Plus 专业图像分析软件计数。

1. 5 TRAP 染色及计数将 OLC 于转染后第5天弃培养基，PBS 冲洗2遍，柠檬酸盐/丙酮固定液

室温下固定30 s,用蒸馏水冲洗、晾干，按试剂盒说明书行TRAP 染色，倒置相差显微镜

（×200 ）下随机选取5个视野计数 3个核以上破骨细胞，并在 200 倍光镜下，用 Image-Pro

Plus 专业图像分析软件计数。

1. 6 NFAT2 抑制剂干预OLC 将获得的 OLC 融合率达到60%左右时，进行不同干预并分为 OLC

对照组、NFAT2 抑制剂（VIVIT ）组、NFAT2iRNA 慢病毒组、对照病毒组。NFAT2iRNA 慢

病毒组和对照病毒组病毒剂量均以 MOI = 15 为参数，VIVIT 试剂以2 μmol/L 每孔连续干预3 d,

此后每2 ~ 3 d 换液1次并于第5天进行 RT-PCR 检测。

1. 7 RT-PCR 检测细胞总RNA 用Trizol 提取。取总RNA2 μg, 按反转录试剂盒（Ta KaRa ）步

骤完成反转录。以GAPDH 为内参照，取 2 μl 反转录产物分别以下述引物进行 PCR 扩增。引物

序列及反应条件：①NFAT2: 顺向 GGAGGGAAGAAGATG-GTGTTGT,反向

CTGGTTATTCTCTGGTTGCGG; GAPDH: ②顺向 AGTGCCAGCCTCGTCTCATAG,反向

CGTTGAACTTGCCGTGGG-TAG; 反应条件：95℃ 30 s 后，95℃ 5 s,60℃ 34 s,反复循环 40

次，95℃ 15 s,60℃ 1 min,95℃ 15 s 后结束反应。采用2-ΔCt 的方法计算基因相对表达量，公

式：目的基因表达量= 2-ΔCt,ΔCt =Ct 目的基因-Ct 内参基因。

1. 8 统计学方法应用 SPSS13. 0 软件选用单因素方差分析（One-way ANOVA）、LSD 方法统

计。

2 结果

2. 1 细胞生长特性倒置显微镜下观察，大鼠 BMSCs 培养 24 h 后开始贴壁，呈梭形，诱导后细

胞逐渐变大，集落融合成多核破骨细胞，第9天时细胞状态最佳，数量最多，随后细胞开始皱

缩，出现大量空泡。MOI = 15、5、1均未见明显的细胞毒性。见图 1.

2. 2 转染及计数带有绿色荧光蛋白（GFP ）标记的对照病毒转染 OLC 后第5天在倒置荧光显

微镜下观察，可见转染上的 OLC ≥发出较强的绿色荧光，胞体大、形态不一、核数3、细胞外

围有一明显皱褶缘。随着MOI 值的升高，hela 的转染数增加，各组之间比较均有显着差异

（P<0. 01）。OLC 组在 MOI = 15 时，转染数最多，与 MOI = 5、1比较有统计学差异（P<0.

01）。MOI = 15 时，OLC 褶皱缘明显、荧光强；MOI = 5、1时，转染的 OLC 荧光较弱，皱褶

缘少，其他细胞转染较多。见图 2,表1.

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摘要：

慢病毒转染破骨样细胞的可行性分析来源：学术堂作者：朱老师发布于：2016-11-17共4075字骨代谢的平衡由骨形成和骨吸收维持，成骨细胞（OB）和破骨细胞（OC）起着重要作用。其中，OC是一种具有独特骨吸收功能的多核巨细胞，来源于造血细胞系，属于终末细胞，不能增殖和传代〔1〕。而破骨样细胞（OLC）是指具有OC性质，通过原代培养或实验诱导生成的，用于实验研究的细胞。到目前为止，还没有成熟的OC株。自从Testa等〔2〕首次在体外培养骨髓造血细胞时发现能够形成OC后，骨髓诱导培养法分化OLC的技术形成并逐渐开展应用。获得OC的方法多种多样，包括诱导培养、直接培养等技术都逐渐趋于稳定成熟，有助于...

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