软骨细胞增殖和迁移中力生长因子的影响
软骨细胞增殖和迁移中力生长因子的影响
来源：中国组织工程研究 作者：赵会;周君琳;杨铁军;
发布于：2019-03-20 共10240 字
摘要： 背景:力生长因子在多种组织中表达, 能够促进多种组织细胞的增殖和迁移。目的:观
察力生长因子对原代培养兔软骨细胞增殖和迁移的影响, 以及内在机制探讨。方法:取北京市维
通利华实验动物技术有限公司提供的新西兰大白兔的膝关节软骨, 剪碎后, 采用酶消化法原代分
离培养软骨细胞, 取处于对数生长期第 3代细胞随机分 5组, 分别以 0, 1, 2, 4, 8μg/L 力生长因子
进行干预 24, 48, 72 h。结果和结论:不同质量浓度的力生长因子均能促进兔软骨细胞的增殖和迁
移, 且效应具有剂量依赖性, 当质量浓度为 4μg/L 时力生长因子促增殖和迁移的效应最大。且随
着力生长因子质量浓度逐渐增加, 可明显增强兔软骨细胞中转化生长因子 β1 的表达, 刺激
Smad2/3 的磷酸化。提示力生长因子对原代培养兔软骨细胞具有促增殖和迁移的作用, 且具有剂
量依赖性, 可能是通过激活转化生长因子 β1/Smad 信号通路得以实现的。
关键词： 软骨细胞; 力生长因子; 增殖; 迁移; 转化生长因子 β1; 软骨细胞; 成骨细胞; 韧带
细胞; 膝关节软骨;
Abstract： BACKGROUND: Mechano growth factor exists in a wide variety of tissues, and it
can enhance the proliferation and migration of cells in different tissues. OBJECTIVE: To investigate
the effect of mechano growth factor on the proliferation and migration of primary rabbit knee articular
chondrocytes, and to explore the underlying mechanism. METHODS: Knee cartilage was shredded
after being harvested from New Zealand white rabbits (provided by Beijing Vital River Laboratory
Animal Technology Co., Ltd.) , and then chondrocytes were isolated and cultured by enzyme
digestion. Passage 3 cells in logarithmic growth phase were harvested and divided into five groups,
and then intervened by 0, 1, 2, 4 and 8 μg/L mechano growth factor for 24, 48 and 72 hours,
respectively. RESULTS AND CONCLUSION: Mechano growth factor could promote the
proliferation and migration of rabbit knee articular chondrocytes in a concentration-dependent manner,
and mechano growth factor at 4 μg/L exhibited the strongest efficacy. Mechano growth factor could
increase the expression of transforming growth factor β1 and phosphorylation of Smad2/3 with
concentration increasing. In summary, mechano growth factor can promote the proliferation and
migration of rabbit knee articular chondrocytes dose-dependently, which may be via the transforming
growth factor β1/Smad signaling pathway.
Author： Zhao Hui, MD, Attending physician, Department of Orthopedics, Beijing Chao-Yang
Hospital, Capital Medical University, Beijing 100020, China;
0 引言
力生长因子是由胰岛素样生长因子基因编码的, 在组织或者细胞处于应激和损伤修复时, 通过对
胰岛素样生长因子基因的 mRNA 进行剪接编码而翻译产生的选择性剪接变异体蛋白[1]。力生
长因子可有效促进肌肉细胞的增殖, 诱导成肌细胞向肌管细胞的分化, 同样也可促进成骨细胞的
增殖和诱导分化[2,3], 但是目前尚没有力生长因子对软骨细胞作用的文章报道。
膝关节软骨是一种透明软骨, 是由蛋白多糖组成的细胞外基质和紧密的胶原网络构成的, 对机械
载荷具有高度抗性, 但是关节软骨的损伤修复能力很差, 同时由于其位置比较特殊, 如何才能更
好地修复关节软骨以最大限度恢复临床患者的功能, 是骨科医生和组织工程师所面临的挑战
[4,5]。
为了观察力生长因子对软骨细胞增殖和迁移的影响, 作者采用不同质量浓度的力生长因子处理
原代培养兔膝关节软骨细胞, 并对其增殖和迁移情况进行检测, 同时评估其对转化生长因
子β1/Smad 信号通路的影响。
1 材料和方法 Materialsandmethods
1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于 2017 年3月至 2018 年3月在河北省廊坊市蓝梦科技有限公司完
成。
1.3 材料
实验动物:雄性清洁级新西兰白兔 1只, 兔龄3周, 体质量 2.13 kg, 购自北京市维通利华实验动物
技术有限公司, 动物许可证号SYXK 京2016-0035。实验方案中有关动物伦理问题已经得到首都
医科大学附属北京朝阳医院动物伦理学委员会的批准, 批准号:2017-科-13。
实验用主要试剂及仪器:力生长因子购自美国Phoenix Pharmaceuticals 公司, 胎牛血清、DMEM
Ⅱ培养基、胰蛋白酶、 型胶原酶购自美国Gibco 公司, CCK-8 购自北京天恩泽基因科技有限公
司, 转化生长因子 β1 抗体、Beta-actin 抗体 (购自美国Abcam 公司, Smad2/3 抗体、P-Smad3 抗体
购自美国Santa Cruz 公司, 荧光倒置显微镜购自日本 Nikon 公司, i MAX 酶标仪购自美国Bio-
Rad 公司,
1.4 方法
1.4.1 软骨细胞的分离与培养耳缘静脉空气针注射空气栓塞法处死新西兰大白兔, 局部备皮, 碘酒
消毒后, 无菌条件下打开膝关节, 用剪刀小心地切除兔的膝关节, 并使用镊子收集软骨组织, 充分
漂洗后, 并将其剪碎至1 mm3 大小, 置于含有体积分数 10%胎牛血清的DMEM 培养基中进行培
养, 荧光倒置显微镜观察原代细胞从软骨组织中的爬出生长情况, 在培养的第 3天更换培养基,
并维持组织碎片以允许更多的软骨细胞长出, 待细胞增殖至瓶底 80%左右时, 弃培养基及组织碎
屑, PBS 反复冲洗 3次, 0.25%胰蛋白酶及 0.2%Ⅱ 型胶原酶消化后, 应用含有体积分数 10%胎牛血
清的DMEM 培养基进行传代培养[6,7,8]。
1.4.2 力生长因子对软骨细胞增殖的影响取对数生长期的 3代软骨细胞, 常规消化离心后, 用含有
体积分数 10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的 DMEM 培养液稀释并计数成 5×106 L-1 后, 然后
以每孔 200μL 接种于 96 孔板中, 置于 37℃体积分数 5%CO2 培养箱中培养, 12 h 后软骨细胞贴
壁, 将接种细胞的培养孔随机分为 5组, 分别加入含有0, 1, 2, 4, 8μg/L 的力生长因子的标准
DMEM 培养基, 每组设5个复孔, 37℃体积分数 5%CO2 培养箱分别孵育 24, 48, 72 h 后, 每孔加
入10μL CCK-8, 孵育 1 h 后终止培养, 吸去培养液, 于iMAX 酶标仪检测 450 nm 处吸光度值, 实
验至少重复3次[9,10,11]。结果以测试孔与对照孔的吸光度比值表示。
1.4.3 力生长因子对软骨细胞迁移的影响首先应用划痕实验检测力生长因子对软骨细胞迁移的影
响, 将软骨细胞以 6×107 L-1 的细胞浓度接种在 6孔板中。培养 24 h 后, 分别加入100μL 含有0,
1, 2, 4, 8μg/L 的力生长因子的标准 DMEM 培养基, 并培养直至细胞聚合用于随后的实验。通过
刮擦塑料移液管的尖端来制造伤口。同以 PBS 洗涤 2次, 然后将细胞与完全生长培养基一起温
育。当细胞迁移到受损的空白区域时, 分别在培养 24 h 时取出细胞, 显微镜观察并测量划痕的宽
度, 并拍摄照片。
进一步应用具有 8.0μm 孔径膜的Transwell 小室进行迁移实验, 用以检测力生长因子对软骨细胞
迁移的影响。选取对数生长期的软骨细胞, 并用含有0, 1, 2, 4, 8μg/L 力生长因子的无血清
DMEM 培养液将细胞浓度调整为5×107 L-1。然后加入上室内, 将600μL 含有体积分数 10%胎
牛血清的培养基加入下室中。37℃体积分数 5%CO2 培养箱分别孵育 3 h 后, 将附着在底部的细
胞用 40 g/L 多聚甲醛固定 30 min, 并0.1%结晶紫染色 15 min, 并在每孔 4个随机选择的 400 倍视
野中进行观察, 计数染色的细胞[12]。1.4.4 Western blot 检测转化生长因子 β1/Smad 信号通路的
变化选取对数生长期的软骨细胞以 5×105/孔接种在六孔板中, 加入含有0, 1, 2, 4, 8μg/L 力生长
因子的培养基, 培养 48 h 后, 收集细胞, 并使用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液 (150 mmol/L
NaCl, 50 mmol/L Tris-HCl, pH7.4 的2 mmol/L EDTA, 1%NP-40) 在培养皿中进行裂解, 然后通过
Bradford 方法定量总细胞蛋白质。将等量的总蛋白质 (每泳道50-100μg) 在12%SDS-PAGE 中电
泳, 后电转移至硝酸纤维素膜上, 在室温下用8%无脂奶粉将膜封闭 2 h, 并在 4℃下与一抗孵育过
夜。在 PBS-Tween 20 中洗涤 3×15 min 后, 将膜用辣根过氧化物酶结合的二抗在室温下孵育 1
h。在 PBS-Tween 20 中再次洗涤膜, 化学发光法检测蛋白表达[13]。
1.5 主要观察指标软骨细胞增殖、迁移以及 β1/Smad 信号通路的表达变化。
1.6 统计学分析所有数据均采用 SPSS 13.0 统计软件(美国SPSS 公司) 进行分析, 重复测量用于
分析增殖实验结果, 单因素方差分析用于分析迁移实验结果, Student's t 检验用于组间比较分
析。数据表示为 x＿±s。P<0.05 为差异有显着性意义。
2 结果 Results
2.1 兔膝关节软骨细胞的形态兔软骨细胞原代培养 24 h 后, 逐渐有软骨细胞从滑膜组织中爬出,
见图 1A, 并贴壁生长, 形态呈现不规则多边形, 培养 72 h 后, 细胞增殖明显增多, 并逐渐铺满培养
瓶, 见图 1B, 传代培养后软骨细胞生长速度明显加快, 见图 1C, 每96 h 传代一次, 使用第 3代细
胞用于后续实验。
2.2 力生长因子促进兔软骨细胞的增殖 CCK-8 检测结果显示, 力生长因子可以促进兔软骨细胞的
增殖, 且随着力生长因子质量浓度的增加, 而细胞增殖逐渐增强。当力生长因子质量浓度达到
4μg/L 时, 其促进增殖的作用最强 (P<0.05) , 见图 2。
2.3 力生长因子促进兔软骨细胞的迁移划痕实验发现, 随着力生长因子质量浓度的升高, 软骨细
胞迁移的数量逐渐增多, 见图 3。迁移实验也得到相似的数据, 细胞计数发现随着力生长因子质
量浓度的增加, 其促迁移的作用逐渐增强, 在质量浓度为 4μg/L 时, 迁移的细胞数目最多 (P<0.05)
, 见图 4, 5。
2.4 力生长因子激活转化生长因子 β1/Smad 信号通路 Western blot 检测结果显示, 随着力生长因
子质量浓度逐渐增加, 转化生长因子 β1 和磷酸化的 Smad2/3 表达水平逐渐增加, 而Smad2/3 表
达水平没有明显变化。提示力生长因子可以增强转化生长因子 β1 的表达, 同时刺激 Smad2/3 的
磷酸化, 见图 6。
3讨论 Discussion
力生长因子是一种自分泌和内分泌的生长因子, 是一种胰岛素样生长因子 1的一类剪接变异体,
其在许多组织中表达[1]。以往的研究报道, 力生长因子可以调节多种类型组织的增殖、分化和
迁移, 可以在应激条件下对机体发挥保护作用。然而, 力生长因子发挥其功能的分子机制尚不完
全清楚。此外, 力生长因子对软骨细胞作用的相关研究也不多[1,2,3]。
摘要：
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软骨细胞增殖和迁移中力生长因子的影响来源：中国组织工程研究作者：赵会;周君琳;杨铁军;发布于：2019-03-20共10240字摘 要：背景:力生长因子在多种组织中表达,能够促进多种组织细胞的增殖和迁移。目的:观察力生长因子对原代培养兔软骨细胞增殖和迁移的影响,以及内在机制探讨。方法:取北京市维通利华实验动物技术有限公司提供的新西兰大白兔的膝关节软骨,剪碎后,采用酶消化法原代分离培养软骨细胞,取处于对数生长期第3代细胞随机分5组,分别以0,1,2,4,8μg/L力生长因子进行干预24,48,72h。结果和结论:不同质量浓度的力生长因子均能促进兔软骨细胞的增殖和迁移,且效应具有剂量依赖性,...
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作者：闻远设计
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