三种皮质神经元培养方法及其比较

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三种皮质神经元培养方法及其比较

来源：学术堂作者：姚老师

发布于：2015-09-25 共4446 字

神经科学是现代科学中进展最为迅猛的研究领域之一，体外原代培养神经细胞的形态学特性及

生长发育特征与体内非常相似，较少受到体内循环、内分泌等因素的影响，且便于直接观察、

检测指标，已成为神经科学研究中必不可少的模型工具，细胞培养的质量将直接影响研究工作

的进展[1 -3].

神经元原代培养是指从活体获得细胞或组织在体外条件下进行的第一次培养，当从胚胎脑组织

中分离培养神经元时，由于他们已在原位组织完成分裂时分化，所以培养的神经元将不再会分

裂、增殖，这使神经元培养与其他种类体细胞培养相比有很大的不同[4].目前，原代皮质神经

元培养的方法有很多，本研究参照相关文献[5 -9],对机械吹打法、胰蛋白酶消化法以及木瓜蛋

白酶法进行比较研究，并在其基础上进行了实验细节的改良，旨在探讨稳定适当的神经元培养

方法及上述三种方法在皮质神经元培养中各自的优缺点，为研究工作者根据各自条件选择合适

的培养方法提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 材料

1. 1. 1 主要试剂及配制

多聚赖氨酸（ L-polysine ）,L- 半胱氨酸（ L-cyste-ine ）, 胰蛋白酶（ tripsin ）, 木瓜蛋白酶（

papain ）, 联咪二苯吲哚（ DAPI ）: Sigma 产品； D-Hank's 平衡液，马血清： Thermo 产品；

DMEM 培养液，双抗（青霉素，链霉素） : Corning Cellgro 产品； Neurobasal Medi-um,B27 培

养基添加剂： Gibco 产品。胎牛血清：上海依科赛生物制品有限公司；兔抗大鼠 NSE 单克隆

抗体，FITC 标记抗兔 Ig G （Abcam ）.

L-polysine 打底液：用灭菌 ddH2O 配至工作浓度 50 μg/mL.Tripsin 消化液：用 D-Hank's 溶液

溶解配至工作浓度 0. 125%; 木瓜蛋白酶消化液（ papa-in ）: 用D-hank' s 溶液配至工作浓度

200μg / mL, 现用现配；接种液配制（体积分数）: DMEM 83. 5%, 胎牛血清 10%, 马血清 5%,双

抗1%,L-半胱氨酸 1% ; 神经元培养液（体积分数）: Neurobasal Medium98% ,B27 2% .所有配

制液体均用0. 22 μm 筛网过滤。

1. 1. 2 实验动物

孕16 ~18 日龄 SPF 级SD 大鼠 1 只，雌性，350~ 400 g ,由湖南斯莱克景达实验动物有限公司

提供[SCXK （湘）2013 -0004].

1. 2 方法

1. 2. 1 神经元培养

包被：L-polysine 打底液包被六孔板，在 37℃ 孵箱孵育30 min 后吸弃液体，晾干过夜后用灭

菌ddH2O 洗板两次，置于37℃ 孵箱孵干备用。取材：断颈处死孕 16 ~18 d SPF 级SD 大鼠，

并在无菌条件下取出胎鼠；剥离胎鼠脑膜，取顶、颞叶大脑皮层的薄层脑组织置于DMEM 溶

液中，进一步剥去未分离的脑膜，并将脑组织剪碎成约1 mm3 大小，然后将脑组织与 DMEM

溶液的混合液分别移入 3 个无菌培养皿，分别标记为机械吹打组、胰酶消化组、木瓜蛋白酶消

化组。分离、培养：机械吹打组：对培养皿中剪碎脑组织吹打 30 次，移入 15 mL 无菌离心

管，离心5 min 1000 r/min. 加入3 mL 接种液后分层吹打，即：吹打 10 次，静置 2 min,取上清

液，再吹打 10 次后，取上清液入离心管，再吹打 10 次后，取上清液入另一无菌离心管。

台盼兰拒染法进行活细胞计数，调整细胞密度（ 1. 0 ×106 个细胞/ 孔）,接种于经包被的培养板

中，置于37℃，5% CO2 的孵箱内孵育；胰酶消化组：在盛有大鼠脑组织的无菌培养皿中加

入2 mL 胰酶消化液，混匀，37℃ 水浴箱消化 15~ 20 min,5 min 观察、摇匀，然后加入等体积

于胰酶消化液的胎牛血清终止消化，并转移至15 mL 无菌离心管中，吹打后离心5 min,1000

r/min,弃上清，加入5 mL 接种液重悬细胞，按前述分层吹打步骤吹打细胞，计数，接种，孵

育；木瓜蛋白酶消化组：在盛有大鼠脑组织的无菌培养皿中加入3 mL 木瓜蛋白酶消化液，混

匀，37℃ 水浴箱消化 20 ~ 30 min, 每5min 摇匀一次，将消化后的组织转移至15 mL 无菌离心

管中，吹打后离心5 min,1000 r/min,弃上清，加入5 mL 接种液重悬细胞，按前述分层吹打步骤

吹打细胞，计数，接种，孵育；各组孵育4 h 后，全量换为神经元培养液，72 h 后全量换液，

以后视细胞生长情况，3 ~ 4 d 半量换液，倒置相差显微镜下观察生长状况。

1. 2. 2 神经元鉴定

免疫荧光鉴定NSE: 4℃ PBS 洗细胞 3 次，4% 多聚甲醛室温固定细胞 10 min,吸去多聚甲

醛，PBS 洗3 次。用 0. 12% Triton X2100 的PBS 对细胞进行透化处理15 min,然后加入封闭

液，室温封闭 1 h. 换为相应一抗（兔抗大鼠 NSE 单克隆抗体） 4℃湿盒过夜，PBS 清洗3 次后

加入FITC 标记的抗兔二抗，室温避光孵育1 h. 然后加入用DAPI 室温染细胞核5 min （避光）

.PBS 漂洗 3 次。90% 甘油封片。

荧光显微镜下观察 NSE 表达阳性细胞，随机取8 个视野，摄像后计算每个视野中NSE 表达阳

性细胞数占该视野总细胞数的比例，即为神经元纯度。

1. 2. 3 统计学处理

应用SPSS 18. 0 分析软件进行方差分析，P <0. 05 视为有统计学差异。

2 结果

2. 1 形态学观察

培养的皮层神经元细胞在接种 4 h 后大部分贴壁，多数贴壁细胞成圆球状，少数细胞出现较小

突起，呈蝌蚪样（图1A、2A、3A ）,6h 后可见明显的细胞突起；至第 24 h 神经元细胞完全

贴壁，光晕明显，突起伸长，可见轴突形成稀疏的网络（图1B、2B、3B ）,随着培养时间延

长，神经元细胞轴突形成的网状结构渐趋密集，3 d 后神经元胞体变大，细胞呈现多样性，多

为纺锤形、三角形及圆形。细胞突起增粗伸长，可见双极或多极神经元，细胞突起交织成疏散

的网状结构，视野中偶见不规则扁平的胶质细胞（图1C、2C、3C ）. 培养 7 d 后神经元胞体进

一步增大且突起延长，形成复杂紧密的神经元网络（图1D、2D、3D ）,此时，神经元成熟稳

定，可以作用实验模型用于进一步实验。

2. 2 神经元鉴定

原代细胞中神经元所占比例高，形态良好，核大而清晰（图2: 4A、5A、6A ）.免疫荧光染色

结果显示 NSE 阳性细胞在机械吹打组（图2: 4B ）、胰酶消化组（图2: 5B ）及木瓜蛋白酶消

化组（图2: 6B ）分别为96. 28% ,95. 63% ,97. 34% , 三组间无统计学差异（P >0. 05 ）.

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三种皮质神经元培养方法及其比较来源：学术堂作者：姚老师发布于：2015-09-25共4446字神经科学是现代科学中进展最为迅猛的研究领域之一，体外原代培养神经细胞的形态学特性及生长发育特征与体内非常相似，较少受到体内循环、内分泌等因素的影响，且便于直接观察、检测指标，已成为神经科学研究中必不可少的模型工具，细胞培养的质量将直接影响研究工作的进展[1-3].神经元原代培养是指从活体获得细胞或组织在体外条件下进行的第一次培养，当从胚胎脑组织中分离培养神经元时，由于他们已在原位组织完成分裂时分化，所以培养的神经元将不再会分裂、增殖，这使神经元培养与其他种类体细胞培养相比有很大的不同[4].目前，原代...

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