上皮细胞相关标志物在角质形成细胞中的表达特征

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上皮细胞相关标志物在角质形成细胞中的表达

特征

来源：学术堂作者：周老师

发布于：2015-06-16 共6219 字

角质形成细胞是鳞状上皮细胞的主要组成成分，具有广泛的生物学特性。常见的鳞状上皮细胞

有皮肤和口腔黏膜上皮细胞，当其出现大面积损伤时创口自身不能正常愈合，只能通过组织移

植来补偿缺损的组织面。皮肤或口腔黏膜是容易接触一些药物或材料刺激的组织，因此探讨皮

肤或口腔黏膜组织对于临床药物和材料的反应是重要的研究课题。

体外细胞检测模型一般来自患者的原代培养细胞或来自肿瘤、遗传物质突变的转化细胞系，但

原代细胞培养获得的细胞有限，传代后组织特异性也逐渐丧失，且组织来源不同的原代细胞培

养所得出的测定数据差异较大，不是毒理学研究的理想细胞；转化细胞容易获得并易于维持，

稳定性高，可重复性好，但其具有肿瘤细胞的特性，例如生长失去控制、接触抑制丧失、细胞

外形改变、核型异常等[1],也不是毒理学研究的理想模型，因此，急需建立新的外源性化合物

安全性的评价模型。人胚胎干细胞（ hu-man embryonic stem cells,hESCs ）是健康和永生的单一

胚胎细胞来源的人类样本，既可真实反映人类生物学特征[2],又可通过单一胚胎细胞无限增殖

和定向分化达到样本高度标准化[3],可能成为预测受试物细胞毒性和遗传毒性的体外替代实验

模型[4], 为体外安全性评价提供了新的希望。将 hESCs 诱导分化为角质形成细胞目前暂无标准

化方法，研究发现通过形成拟胚体（ embryonic body,EB ）的方法获得的角质形成细胞增殖能

力过低，不利于组织发育[5]; 2008 年，Metallo 等[6] 用直接诱导法将 hESCs 诱导分化为上皮细

胞的前体细胞，并比较了 EB 法和直接诱导法诱导 hESCs 5 周后获得的细胞角蛋白（

cytokeratin,CK ）14 的阳性表达率（ 15% vs. 87% ）,发现直接诱导法具有显著的优势。

人永生化口腔上皮细胞系（ human immortalizedoral epithelial cells,HIOECs ）是用人乳头瘤状病

毒E6、E7 开放读码框架转染原代培养的正常口腔上皮细胞后建立的[7],HIOECs 具有与口腔黏

膜上皮细胞相似的形态和生化特性，所建模型可被用于评价药物在口腔吸收机制的研究[8].人

永生化皮肤角质形成细胞 HaCaT 是由成人皮肤转染猴空泡病毒 40 （simian virus,SV40 ）后发

生自分化的未成瘤的永生化皮肤角质形成细胞系[9].

本课题组前期实验亦通过直接诱导法将 hESCs 诱导分化为上皮样细胞[10],但尚不清楚所得到的

上皮样细胞是否仍保持正常的染色体核型，其进一步分化是趋向于发展为皮肤上皮还是口腔黏

膜上皮，以及能否作为将来毒理学的检测模型。本研究对得到的上皮样细胞进行了染色体核型

的分析，在基因水平上探讨了由hESCs 诱导 K-hESCs 过程中多能性标志物及上皮相关标志物

的表达变化；并以人原代牙龈上皮细胞（ human gingival epithelial cells,HGECs ）、HIOECs

和HaCaT 作为对照细胞，通过实时定量荧光 PCR 方法检测了其诱导末期人胚胎干细胞源角质

形成细胞（ keratinocyte derived from hu-man embryonic stem cells,K-hESCs ）与对照细胞上皮相

关标志物基因表达的差异性；在蛋白水平上，通过免疫组织化学方法探讨了多种上皮细胞相关

标志物在K-hESCs 和对照细胞中的表达差异。

1 材料与方法

1. 1 材料

研究所用明胶、Matrigel 购自美国 BD 公司，胚胎干细胞完全培养基（mTeSR1 ）购自美国

Stem Cell 公司，中性蛋白酶购自德国 Roche 公司，CK 、波形蛋白（ vimentin,VIM ）抗体购自

美国 Santa Cruz 公司，细胞培养瓶及培养皿购自美国 Corning 公司，通用型二步法检测试剂盒

购自美国 GBI 公司，TritonX-100 购自美国 Amresco 公司，Gimsa 染液购自北京 Solarbio 公

司；其他研究所用材料全部购自美国 Invitrogen 公司。

1. 2 细胞培养

1. 2. 1 hESCs 的培养人胚胎干细胞系 H9 （H9-hESCs ）由新加坡国立大学提供，将其培养于

Matri-gel 上，培养液为胚胎干细胞完全培养基，每天换液，细胞接近汇合时用 1 g/L 的中性蛋

白酶，37 ℃消化5 min,机械刮除，800 r / min 离心 5 min,1 6 ∶传代。

1. 2. 2 HGECs 的原代培养选择拟行阻生牙拔除术、无口腔黏膜疾病且冠周龈组织无炎症表现

的患者，术前征得患者同意，术中收集拔除牙齿上附带的牙龈组织，采用组织块法在无血清上

皮培养基（de-fined keratinocyte serum-free medium and supplement,D-KSFM ）中培养获得

HGECs. 本研究获得北京大学生物医学伦理委员会批准（批准号：PKUSSIRB-201310055 ）.

1. 2. 3 HIOECs 及HaCaT 培养分别使用D-KSFM 和含10% （体积分数）血清的DMEM 高糖

培养基培养 HIOECs 与HaCaT, 传代时均用胰酶 37 ℃ 分别消化5 min 和1 min,用含血清培养基

中和，前者 600 r/min 离心 10 min, 后者 1 000 r / min 离心 5 min,1 3∶传代。

1. 3 诱导 hESCs 分化为 K-hESCs.H9-hESCs 常规传代后第2 天，将 hESCs 完全培养基换成上

皮分化诱导液（体积分数98% 的DMEM / F12 培养基，含有1 × N2 补充成分、1 μmol /L

维甲酸、25 μg / L 骨形成蛋白 4 ）, 每天换液，连续诱导 7 天，第7 天传代。传代时用 1 g/L 的

中性蛋白酶，37 ℃ 消化5 min,机械刮除，D-KSFM 重悬，200 × g 离心 4 min,D-KSFM 重悬轻吹

匀，1 3 ∶传代至明胶铺被的板子上，晃匀，隔天换液。P1 代第10 天时K-hESCs 用胰酶 37

℃ 消化1 min,含血清培养基中和，200 × g 离心 4 min,D-KSFM 重悬轻吹匀，1 1 ∶传代至明胶

铺被的板子上，晃匀，隔天换液。

1. 4 Real-time PCR 检测方法。

Trizol 法提取细胞总RNA, 取2 μL RNA 检测纯度和浓度，20 μL 体系逆转录为cDNA, 以

GAPDH 为内参，PCR 引物序列见表 1,20 μL 体系在7500 实时 PCR 检测仪（美国 ABI 公司）

上行定量PCR 检测。

1. 5 免疫细胞化学检测

将细胞均匀接种在无菌的载玻片上，待贴壁生长至合适密度后，95% （体积分数）乙醇固定

30min,PBS 冲洗，0. 1% （体积分数） Triton-X 100 室温处理15 min,PBS 冲洗；10% （质量

分数） H2O2 室温处理10 min,PBS 冲洗；滴加一抗，4 ℃ 过夜。第2天滴加二抗试剂，室温

孵育30 min,PBS 冲洗；DAB 室温显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。

SOX2[SRY-related high-mobility-group （HMG ）-box protein-2 ]、OCT4 （octamer-binding

transcriptionfactor-4 ）、CK1、P63 以核内有着色颗粒为阳性判断标准，余以细胞浆内有着色颗

粒为阳性判断标准。采用半定量分析判定阳性表达强度，无着色颗粒或阳性细胞数少于5% 为

阴性（ - ）,着色且着色总面积在5% ~10% 为弱阳性（ + ）, 着色总面积在11%-50% 为中等阳

性（ + + ）, 着色总面积大于 50% 者为强阳性（ + + + ）.

1. 6 二倍体检测

生长状态良好的 K-hESCs, 加入 0. 012 mg/L 秋水仙素培养 8 h, 收集细胞，加入预温至 37 ℃ 的0.

075 mmol / L KCl 溶液 5 mL, 置37 ℃ 15 min,用3 1 ∶ 甲醇冰醋酸固定3 次，滴到预冷的载玻片

上，70 ℃ 3 h 烤片。Gimsa 染色10 min,水洗，显微镜下观察染色体并进行核型分析。

1. 7 统计学分析

利用 SPSS 16. 0 软件进行统计学分析，采用多组间比较的单因素方差分析、成组设计多个样本

比较的秩和检验（ Kruskal-Wallis 法）及完全随机设计两独立样本的秩和检验分析方法，P < 0.

05 为差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 培养细胞形态和鉴定

2. 1. 1 细胞形态原代培养的 HGECs 呈铺路石样紧密排列的上皮样细胞形态，细胞大小一致，

形态规则，细胞核清晰（图1A ）; HIOECs 为分散生长的多角形上皮样细胞，细胞大小较一

致，生长较慢（图1B ）;HaCaT 细胞呈克隆状聚集生长，细胞为多角形，长满后也为铺路石

样，生长较快（图1C ）.未分化的 H9-hESCs 在Matrigel 上细胞成团克隆状生长，饱满厚实，

排列紧密，形似鸟巢，细胞之间界限不清，胞体体积小，核大，有 1 个或几个核仁，细胞增殖

并保持未分化状态（图1D ）. 用上皮分化培养基诱导得到的 P1 代细胞以组织块贴壁细胞为中

心呈现克隆状生长，细胞呈铺路石状，排列紧密；以小圆形、多角形为主的上皮样细胞，克隆

中央的细胞较小且排列较紧密，克隆周围的细胞较大且大小较一致，细胞核清晰（图1E ）,类

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摘要：

上皮细胞相关标志物在角质形成细胞中的表达特征来源：学术堂作者：周老师发布于：2015-06-16共6219字角质形成细胞是鳞状上皮细胞的主要组成成分，具有广泛的生物学特性。常见的鳞状上皮细胞有皮肤和口腔黏膜上皮细胞，当其出现大面积损伤时创口自身不能正常愈合，只能通过组织移植来补偿缺损的组织面。皮肤或口腔黏膜是容易接触一些药物或材料刺激的组织，因此探讨皮肤或口腔黏膜组织对于临床药物和材料的反应是重要的研究课题。体外细胞检测模型一般来自患者的原代培养细胞或来自肿瘤、遗传物质突变的转化细胞系，但原代细胞培养获得的细胞有限，传代后组织特异性也逐渐丧失，且组织来源不同的原代细胞培养所得出的测定数据差异较...

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