探讨p75NTR作为预测口腔鳞状细胞癌愈后指标的可能性

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探讨 p75NTR 作为预测口腔鳞状细胞癌愈后指

标的可能性

来源：学术堂作者：姚老师

发布于：2014-06-05 共4031 字

肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）是肿瘤组织中具有自我更新、多向分化及较强增殖能力

的少量干细胞样癌细胞亚群，是肿瘤起源、生长、转移与复发的根源所在。近年来，寻找靶向

杀死肿瘤干细胞的抗癌策略已成为研究的热点。其中，选择何种细胞表面标志物来证实舌癌中

肿瘤干细胞的存在并完成对肿瘤干细胞的提取和鉴别是首要亟待解决的问题。研究发现 p75 神

经营养蛋白受体（p75 neu-rotrophin receptor，p75NTR）的表达与多种肿瘤的发生和发展相关，

并已证实其在全身多种肿瘤中可以作为一种肿瘤干细胞的表面标志物。本实验采用 p75NTR 对

舌鳞状细胞癌细胞系 Tca-8113 及Cal-27 进行标记、检测、分选，并对分选后的 p75NTR 阳性细

胞进行生物学特性研究，探讨 p75NTR 作为肿瘤干细胞标志物和预测口腔鳞状细胞癌愈后指标

的可能性，为深入研究舌鳞状细胞癌的发病机理和寻找新的治疗靶点提供线索。

1 、材料和方法

1.1 材料

Tca-8113、Cal-27 细胞株来源于口腔舌鳞状细胞癌，由上海交通大学附属第九人民医院口腔颌

面外科肿瘤生物实验室惠赠。Tca-8113 细胞株用含 10%FBS（杭州四季青生物工程材料研究

所）的 RPMI1640 培养液培养。Cal-27 细胞株用含 10%FBS（GIBCO 公司，美国）的高糖

DMEM 培养液培养。

PE 标记的鼠抗人 p75NTR 抗体及 PE 标记的小鼠骨髓瘤蛋白 IgG1,κ 抗体均购自美国 BD 公司。

1.2 流式细胞仪检测 p75NTR 阳性细胞的表达。将生长状况良好并处于对数生长期的 Tca-8113

细胞制备成单细胞悬液，并且调整细胞密度为 1.0×106 个·mL-1。实验分为 2组，实验组加入

100 μL PE 标记小鼠抗人 p75NTR 抗体，对照组加入等量的 PE 标记小鼠骨髓瘤蛋白 IgG1,κ。放

入冰里置于震荡箱中蔽光孵育半小时，1 000 r·min-1 离心 5 min，吸弃上清后 Buffer I l mL 冲洗

吹打（反复冲洗、离心 2次），重悬于 400 μL PBS 中。将加入等量 PE 标记小鼠骨髓瘤蛋白

IgG1,κ 的对照组先上机调节机器参数，然后取实验组上机检测细胞荧光值，分析p75NTR 阳性

细胞的百分含量，重复3次取平均值。同法处理 Cal-27 细胞。

1.3 p75NTR 阳性细胞生物学特性检测 1.3.1 以p75NTR 为标记分选阳性细胞作为实验组将生长

状况良好并处于对数生长期的较大数量的 2种舌鳞状细胞癌细胞（约1.0×108 个·mL-1）如上法

处理后上机进行高速分选，获得 p75NTR 阳性细胞，作为实验组。为了保证分选后富集的

p75NTR 阳性细胞的纯度，分选时选取强阳性区域。重复上机一次，以避免标记物丢失造成的

阳性率偏低。并取适量分选后的细胞上机检测 p75NTR 阳性细胞的纯度。

1.3.2 对照组处理将同等条件培养的 2种舌鳞状细胞癌细胞系细胞制备成单细胞悬液，加入 PE

标记小鼠抗人 p75NTR 抗体，放入冰里置于震荡箱中蔽光孵育半小时，再放入离心机离心 5

min（1 000 r·min-1），弃上清后 Buffer I l mL 冲洗吹打（反复冲洗、离心 2次），作为对照组

备用。

1.3.3 单克隆培养取对数生长期的 2组细胞于超净台中常规消化制成单细胞悬液后，用有限稀

释法接种于 96 孔板中。5%CO2、37 ℃饱和温度环境培养观察细胞贴壁情况，记录仅有一个细

胞的孔，并做标记。2周后统计单克隆形成率。收集 p75NTR 阳性细胞形成的单克隆细胞，培

养于培养瓶中，再培养 2周后进行 p75NTR 的流式细胞检测。

1.3.4 四甲基偶氮唑盐比色法[(3-(4,5)-demethylthiazo(z-y1)-3,5-diphenytetrazoliumromide，MTT]

实验收集 2组细胞，分别接种于 96 孔细胞培养板中（每孔约 4×103 个细胞）（周边空不

加），再各加入 200 μL 培养液（周边空不加，B3 孔只加入 PBS 作为对照）。

培养 24 h 后，换液，B3 孔换 200 μL PBS。每孔加入 20 μL MTT 溶液，培养 4 h 后吸出上清

液，加入 150 μL 二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），置于摇床上低速震荡 10 min。以

B3 孔为调零孔，上酶联免疫检测仪，以 490 nm 吸光度值量化活细胞数，每次检测一竖列的6

个平行孔，每组所得数据取平均值，连续检测 7 d。以生长时间为横坐标，以光密度（op-tical

density，OD）值为纵坐标，绘制细胞的生长曲线。

1.3.5 划痕实验将 2组细胞以每孔 1×105 个的密度接种于六孔板中，待细胞生长到80%~90%

时，无菌条件下更换为无血清的培养基，继续培养 12 h 后，于超净台中用 200 μL 枪头在每个

孔的中间划一条竖直的线，PBS 冲洗 3遍。每孔加入 2 mL 完全培养液，倒置显微镜下观察并

拍照记录。之后每天换液，拍照，连续 8 d。

1.4 统计学分析

采用 SPSS 13.0 软件进行统计学分析。各组间的比较采用 χ2 检验进行分析，P<0.05 为差异有统

计学意义。

2 、结果

2.1 流式细胞仪检测 p75NTR

阳性细胞的表达舌鳞状细胞癌细胞株 Tca-8113、Cal-27 细胞中，p75NTR 阳性细胞的比例分别

为3.1%和1.9%。

2.2 流式细胞分选及纯度检测

分选后 p75NTR 阳性细胞的比例分别为 98.1%（Tca-8113）和 97.4%（Cal-27）。这表明目的细

胞阳性率比较高。

2.3 单克隆培养

2组单克隆形成能力的比较见表1。从表1可见，只有小部分细胞能持续分裂增殖。实验组的

单克隆形成能力高于对照组（Tca-8113 细胞，P=0.024；Cal-27 细胞，P=0.009）。这表明

p75NTR 阳性细胞具有自我更新和分化能力。单克隆细胞再培养 2周后，Tca-8113 的p75NTR

阳性细胞率降为14.5%，Cal-27 的p75NTR 阳性细胞率降为5.8%。

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探讨p75NTR作为预测口腔鳞状细胞癌愈后指标的可能性来源：学术堂作者：姚老师发布于：2014-06-05共4031字肿瘤干细胞（cancerstemcells，CSCs）是肿瘤组织中具有自我更新、多向分化及较强增殖能力的少量干细胞样癌细胞亚群，是肿瘤起源、生长、转移与复发的根源所在。近年来，寻找靶向杀死肿瘤干细胞的抗癌策略已成为研究的热点。其中，选择何种细胞表面标志物来证实舌癌中肿瘤干细胞的存在并完成对肿瘤干细胞的提取和鉴别是首要亟待解决的问题。研究发现p75神经营养蛋白受体（p75neu-rotrophinreceptor，p75NTR）的表达与多种肿瘤的发生和发展相关，并已证实其在全身多...

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