探讨Sirt3对人脐静脉内皮细胞衰老的影响机制

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探讨 Sirt3 对人脐静脉内皮细胞衰老的影响机制

来源：学术堂作者：周老师

发布于：2015-06-16 共3012 字

内皮细胞衰老引起的内皮细胞功能减退是心脑血管疾病随年龄增加的主要因素之一[1-2].氧化应

激是导致细胞衰老的主要原因之一。随着年龄的增加，内皮细胞活性氧（ reactive oxygen

species,ROS）的产生增多、清除减少，导致其在内皮细胞内积聚，并最终导致内皮细胞衰老、

损伤及功能失调[3].

Sirtuins 家族是一类依赖烟碱胺腺嘌呤二核苷酸（ NAD ）的组蛋白去乙酰化酶，Sirt3 是

Sirtuins 家族的成员[4].研究表明，Sirt3 可通过去乙酰化相关蛋白，抑制线粒体内 ROS 的蓄积

[5]. 提示 Sirt3 可通过抑制血管内皮细胞线粒体内 ROS 的蓄积，抑制血管内皮细胞的衰老过

程。本研究通过 Sirt3-siRNA 抑制 Sirt3 蛋白的表达，观察人脐静脉内皮细胞（ hu-man

umbilical vein endothelial cells,HUVECs ）β-gal 阳性染色率、细胞衰老相关蛋白 P16 及P21 的

表达、ROS 蓄积水平，旨在探讨 Sirt3 对HUVECs 衰老的影响及其可能的机制。

1 材料与方法

1. 1 材料

1. 1. 1 实验细胞 HUVECs, 购自美国 ATCC 公司。

1. 1. 2 主要试剂 ECM 培养基购自美国 Sciencell 公司；胰蛋白酶、DCFH-DA 均购自美国

Sigma 公司； Sirt3-siRNA 序列由上海吉玛生物制药有限公司合成；脂质体

LipofectamineTM2000 购自美国 Inven-trogen 公司； Opti-MEM 购自美国 Gibco 公司； β-半乳

糖苷酶染色试剂盒、免疫印迹试剂盒和 BCA 蛋白定量试剂盒均购自上海碧云天生物科技有限

公司；兔来源 Sirt3 单克隆抗体、小鼠来源 P16 单克隆抗体、兔来源 P21 单克隆抗体均购自美

国Santa CruzBiotechnology 公司；兔来源 β-actin 单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗

兔IgG 、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠 IgG 均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1. 2 方法

1. 2. 1 HUVECs 的培养与分组将复苏后的 HUVECs 接种于 ECM 培养基中，置于 37 ℃ 、5%

CO2 细胞孵育箱中常规培养。取 3 ~7 代HUVECs 种板并行同步化处理，并将细胞分为对照组

和Sirt3-siRNA 组。

1. 2. 2 Sirt3-siRNA 转染 HUVECs 及抑制序列的筛选用不含抗生素的培养基接种细胞于 6 孔板

中，置于 37 ℃、5% CO2 培养箱中培养 24 h, 转染时细胞的融合度达到 50%左右。实验分为对

照组、抑制序列 1 组、抑制序列 2 组、抑制序列 3 组。各抑制序列均根据 Sirt3 mRNA 序列以

化学合成法设计合成。3 条抑制序列分别为：抑制序列 1,Sirt3-homo-340; 抑制序列 2,Sirt3-

homo-752; 抑制序列3,Sirt3-homo-1613. 转染方法按LipofectamineTM2000 说明书操作。转染

48 h 后提取细胞总蛋白，用 Westernblotting 法筛选出抑制效率最高的一组抑制序列。

1. 2. 3 Western blotting 法检测细胞中 Sirt3、P16 及P21 的蛋白表达应用细胞裂解液（RIPA 与

PMSF 按100 1 ∶ 配制）充分裂解细胞，提取各组 HUVECs 总蛋白，用 BCA 蛋白定量试剂盒

测定各样品蛋白浓度，并调整各样品上样量为 40 μg, 行8% ~ 12%SDS-PAGE 凝胶电泳后转到

PVDF 膜上。5% 的脱脂奶粉室温封闭 2 h 后，分别加入兔抗 Sirt3、鼠抗 P16 、兔抗 P21 和兔抗

β-actin 抗体 4 ℃ 摇床过夜。第2 天用 1 × TBST 洗膜后，在辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或

山羊抗鼠 IgG 中室温孵育 1 h,1 ×TBST 洗涤后进行暗室曝光显影。Image J 软件测量相对灰度

值。

1. 2. 4 β- 半乳糖苷酶染色法检测 HUVECs 的衰老具体步骤根据试剂盒说明操作。待Sirt3-siRNA

刺激细胞 48 h 后，弃去6 孔板中的原培养基，用 PBS 冲洗 3 遍后，加入4% 的多聚甲醛固定

20 min. 再用PBS 冲洗 3 遍后，加入2 mL 染色工作液37 ℃孵育过夜。普通光学显微镜下观

察。

1. 2. 5 DCFH-DA 法测定HUVECs 内ROS 水平待Sirt3-siRNA 刺激细胞 48 h 后，弃去6 孔板中

的原培养基，用 PBS 冲洗 2 遍后，加入含终浓度为 10 μmolDCFH-DA 的无血清培养基 1 mL.37

℃ 、5% CO2 细胞孵育箱中孵育 20 min 后，用无血清培养基冲洗 3 遍，于激光共聚焦显微镜下

观察 ROS 荧光强度并拍照。

1. 3 统计学处理采用GraphPad Prism 6 软件，所有数据均以 x ± s �� 表示，对照组与 3 个抑

制序列组比较采用单因素方差分析；Sirt3-siRNA 组与对照组比较采用t 检验。P <0. 05 为差异

有统计学意义。

2 结果

2. 1 Sirt3-siRNA 抑制序列的筛选见图 1.3 组抑制序列中，抑制序列 1 的Sirt3 蛋白表达量最

低，且明显低于对照组，所以抑制序列 1 抑制效率最高，故选择序列 1 进行后续实验。

2. 2 Sirt3-siRNA 对衰老相关基因 P16 和P21 蛋白表达的影响见图 2.结果显示与对照组相

比，Sirt3-siRNA 组Sirt3 蛋白表达明显减少，P16 和P21 蛋白表达水平明显升高（P <0. 05 ）.

2. 3 HUVECs β- 半乳糖苷酶染色见图 3.结果显示，Sirt3-siRNA 组β-半乳糖苷酶染色阳性率明

显高于对照组。

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摘要：

探讨Sirt3对人脐静脉内皮细胞衰老的影响机制来源：学术堂作者：周老师发布于：2015-06-16共3012字内皮细胞衰老引起的内皮细胞功能减退是心脑血管疾病随年龄增加的主要因素之一[1-2].氧化应激是导致细胞衰老的主要原因之一。随着年龄的增加，内皮细胞活性氧（reactiveoxygenspecies,ROS）的产生增多、清除减少，导致其在内皮细胞内积聚，并最终导致内皮细胞衰老、损伤及功能失调[3].Sirtuins家族是一类依赖烟碱胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的组蛋白去乙酰化酶，Sirt3是Sirtuins家族的成员[4].研究表明，Sirt3可通过去乙酰化相关蛋白，抑制线粒体内ROS的蓄...

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