探讨气体压力下HKC上清液对HFB的生物学作用

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探讨气体压力下 HKC 上清液对 HFB 的生物学

作用

来源：学术堂作者：刘老师

发布于：2014-05-26 共5535 字

一、引言

近年研究表明,表皮与真皮的相互作用,特别是角质形成细胞(human keratinocytes,HKC)与成纤维

细胞(human fibroblasts,HFB) 的相互作用,在促进组织生长、维持组织内环境稳态、创伤愈合及

瘢痕形成等方面具有极其重要的作用[1~4] .随着研究的深入, 人们发现 HKC 影响 HFB 分泌胶原

蛋白;反之,HFB 通过旁分泌的形式促进 HKC 增殖[5],这两种细胞的相互作用对伤口的愈合及再

上皮化均有明显的调控作用[6,7].增生性瘢痕是人体皮肤创伤修复过程中的常见疾病,主要以成

纤维细胞的过度增生及细胞外基质的过度沉积和降解不足为特征,严重影响患者的身体和心理健

康.HFB 是创伤修复过程中真皮的主要功能细胞,近年来,HFB 与增生性瘢痕的关系已成为研究的

热点.

通过外部加压来抑制瘢痕形成的加压疗法自 20 世纪 70 年代以来在临床上得到了广泛的认可和

应用,但是,其作用机理研究中有关压力下 HKC 对HFB 的作用研究相对较少.为此,我们通过自行

研制的可控压力密闭细胞培养装置,初步探讨气体压力下 HKC 上清液对 HFB 的生物学作用.材

料和方法主要材料 DispaseⅡ 购自瑞士 Roche 公司,CollagenⅡ、胰蛋白

酶、EDTA、MTT、DMSO 购自美国 Sigama 公司,人角质形成细胞培养基 K-SFM、胎牛血清

FBS 购自美国 Gibco 公司,DMEM 高糖培养基购自美国 Hyclone 公司,羟脯氨酸测试盒购自南京

建成生物工程研究所,兔抗人角蛋白 K19 单克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司,羊抗兔

SABC 即用型试剂盒、DAB 显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司.

气体压力装置的设计可控压应力密闭容器的工作原理是:将95%空气、5% CO2 的混合气体经

0.22 μm 滤器过滤后充入可控压应力密闭容器,通过控制储气罐上的气体流量计及密闭容器上的

进、出气口开关,使密闭容器内的气体压力稳定在实验需要设定的压力值,通过密闭容器上方的

压力表显示容器内的气体压力.该装置易操作,安全性、可靠性高.实验时,将种植有细胞的器皿放

入密闭容器中, 然后将密闭容器放到37℃ 的CO2 孵育箱里. 无压力对照组放进同一个CO2 孵育

箱.

二、细胞培养及 HKC 的鉴定

细胞提取和培养

取健康汉族成人包皮环切术后的皮肤组织(由太原东方医院提供,患者具有知情权),用含青、链霉

素的PBS 彻底清洗,无菌条件下去除皮下脂肪、血凝块等杂物,表皮面朝上,0.25% DispaseⅡ4℃过

夜分离表皮和真皮, 采用胰酶消化法提取 HKC, 用K-SFM 培养 HKC. 采用胶原酶消化法原代培养

HFB, 用含10% 胎牛血清的 DMEM 高糖培养基培养 HFB, 每隔 1~3 d 换液一次.

待原代 HKC 生长融合至60%时, 换为无细胞因子 EGF 与BPE 的HKC 专用培养基 K-SFM, 培养

48 h 后收集上清液, 保存于4℃备用.使用时, 以DMEM 稀释配置为 50%浓度. 待原代 HFB 生长融

合至80%后, 用含0.02% EDTA 的0.25% 胰蛋白酶按1 3 ∶比例传代.本实验使用第三代生长状态

良好且处于对数增殖期的细胞.

HKC 鉴定

待原代 HKC 生长融合至80%时, 用含0.02% EDTA 的0.25%胰蛋白酶消化细胞,以每孔 104 个接

种于 96 孔板, 采用人角蛋白 K19 对HKC 进行鉴定. 细胞经 4%甲醛溶液固定后,参照文献[8]按试

剂盒说明书应用 SABC 法、DAB 显色及苏木精复染法,显微镜下观察 HKC.

实验分组 HFB 以2×104 个密度接种于 24 孔板 24 h 后, 用DMEM 与HKC 上清液 (1 1) ∶混合液

培养,并以DMEM 与K-SFM (1 1) ∶ 混合液培养的 HFB 为对照组, 培养 24 h 后,部分细胞用 3.4

kPa 气体压力分别加载5 h 或10 h, 另一部分细胞无压力培养 5 h 或10 h 作为对照组,实验分为 4

组.A 组:K-SFM 与DMEM (1 1) ∶ 混合液及无压力加载培养的 HFB;B 组:HKC 上清与 DMEM ( 1

1) ∶ 混合液及无压力加载培养的 HFB; C 组: K-SFM 与DMEM (1 1)∶混合液及加载3.4 kPa 气体

压力培养的 HFB;D 组:HKC 上清与 DMEM(1 1)∶混合液及加载3.4 kPa 气体压力培养的 HFB.

三、MTT 法测定成纤维细胞的增殖情况

在3.4 kPa 气体压力加载5 h 或10 h 后,各组细胞每孔中加入 MTT (5 g/L) 50 μl,每组重复 5孔

(n=5),37℃、5% CO2 孵育箱培养 4 h 后, 加入 DMSO 150 μl, 振荡 15 min 直至结晶物完全溶解.

在酶联免疫检测仪上测定各组HFB 的吸光值( OD 值),检测波长为 490 nm,记录结果.OD 值代表

活细胞的相对数量,OD 值增大,表明活细胞数量增多;反之,表明活细胞数量减少.

羟脯胺酸比色法测定上清液中胶原蛋白的分泌量

在3.4 kPa 气体压力加载5 h 或10 h 后, 收集各组上清液 0.5 ml 于试管中, 每组重复 3孔(n=3),严

格按照试剂盒操作说明书测定各组上清液中羟脯氨酸在 550 nm 处的吸光值(OD 值),并根据公式

计算羟脯氨酸含量, 间接反映各组HFB 胶原蛋白的含量.计算公式为:羟脯氨酸含量(μg/mL) =

[( 测定管吸光度- 空白管吸光度) / ( 标准管吸光度- 空白管吸光度)] ×标准管含量×水解液总体积

(ml) /取样量(ml).

其中,HKC 上清液与 DMEM(1 1)∶ 混合液培养 HFB 组, 以HKC 上清液与 DMEM (1 1) ∶混合液

为空白;K-SFM 与DMEM (1 1)∶ 混合液培养 HFB 组, 以K-SFM 与DMEM (1 1) ∶混合液为空白.

四、统计学处理

实验结果以x±s 表示, 采用SPSS 19.0 统计分析软件以单因素方差分析数据,检测各组之间是否存

在差异,P<0.05 为具有统计学差异, 图表采用Origin 8.0 软件制作.

五、结果

细胞培养及 HKC 的鉴定

培养的表皮细胞接种24 h 后,可见部分细胞贴壁,细胞呈圆形、三角形或椭圆形, 贴壁 3 d 可以形

成小的集落,10 d 左右细胞融合成片, 呈现典型的铺路石样排列 ( 如图 1). 经兔抗人 K19 免疫细胞

化学染色显示: 细胞浆内K19 染色阳性,呈棕黄色,衬染的核为蓝色( 如图 2),说明所提取的人表皮

细胞为 HKC. 消化法培养的 HFB 刚接种时呈球形,24 h 左右大部分细胞开始贴壁生长,7 d 左右融

合.

倒置相差显微镜下观察,可见细胞呈长梭形生长,排列紧密,呈典型漩涡状走行(如图 3).

各组中成纤维细胞的增殖情况

经单因素方差检验,FOD=31.542,dfOD=7, 如图 4 所示,同一时间点不同组之间进行比较发现:HKC

上清液作用 5 h 后,B 组OD 值显著高于 A 组(P<0.05),其它组之间无统计学差异;HKC 上清液作

用10 h 后,B 组OD 值显著高于 A 组(P<0.05),D 组OD 值显著高于 C 组(P<0.05),其它组之间无

统计学差异.

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摘要：

探讨气体压力下HKC上清液对HFB的生物学作用来源：学术堂作者：刘老师发布于：2014-05-26共5535字一、引言近年研究表明,表皮与真皮的相互作用,特别是角质形成细胞(humankeratinocytes,HKC)与成纤维细胞(humanfibroblasts,HFB)的相互作用,在促进组织生长、维持组织内环境稳态、创伤愈合及瘢痕形成等方面具有极其重要的作用[1~4].随着研究的深入,人们发现HKC影响HFB分泌胶原蛋白;反之,HFB通过旁分泌的形式促进HKC增殖[5],这两种细胞的相互作用对伤口的愈合及再上皮化均有明显的调控作用[6,7].增生性瘢痕是人体皮肤创伤修复布中的常见疾病,主...

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