探讨维甲酸诱导HAEC在体外分化为神经样细胞的最适浓度
探讨维甲酸诱导 HAEC 在体外分化为神经样细
胞的最适浓度
来源：学术堂 作者：姚老师
发布于：2014-08-06 共5810 字
目前，国内外研究多集中于干细胞向神经细胞分化的研究，而对体细胞的研究相对较少。干细
胞存在伦理学、免疫排斥以及潜在的致瘤性等问题限制了其在临床上的应用，而具有部分胚胎
干细胞特性的人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells，HAEC)不存在上述问题，从而为
细胞治疗提供了新的选择。
HAEC 是一种来源于人胎盘羊膜组织的上皮层体细胞。研究显示 HAEC 具有部分胚胎干细胞特
性，即在体外培养下具有向 3个胚层分化的潜能：内胚层(胰腺细胞、肝细胞)、中胚层(心肌细
胞)和外胚层(神经细胞、肌细胞、心肌细胞，骨细胞，脂肪细胞，胰腺细胞，肝细胞)。细胞生
活的微环境在分子水平决定了细胞的分化方向，因此在维甲酸诱导体外培养的 HAEC 向神经样
细胞分化的过程中，选择最佳维甲酸干预浓度是决定成功与否的关键。本实验通过细胞形态学
分析和检测细胞内巢蛋白(nestin)、微管相关蛋白 2(MAP-2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和转录
因子 Oct-4 表达，探讨维甲酸诱导 HAEC 在体外分化为神经样细胞的最适浓度，为 HAEC 在细
胞移植中的应用奠定基础。
材料与方法
材料与试剂 羊膜标本由复旦大学附属中山医院妇产科提供，本研究经产妇本人签署知情同意
书，并经中山医院伦理委员会同意。DMEM/F12、特级胎牛血清、PBS 缓冲液、青霉素-链霉素
双抗溶液、0.25%胰蛋白酶+0.02EDTA (GibcoLtd，美国) Ⅱ。 型胶原酶、Dnase 酶(Sigma Ltd，美
国)。鼠抗人 vimentin 单克隆抗体(SR0746，EpitomicsInc，美国)。鼠抗人 CK-19 抗体
(BM0033)、兔抗人 Nestin 多抗(BA1289)、鼠抗人 MAP-2 多抗(BM1243)、兔抗人 GFAP 多抗
(BA0056)(武汉博士德生物工程有限公司，中国)。兔抗人 Oct-4 多抗(MAB4305) (Millipore
Ltd，美国)。100、200、300、400 筛网(上海瑞谷生物科技有限公司，中国)。
羊膜组织提取和处理 HIV、梅毒、乙肝等血清学反应阴性的足月剖宫产后胎盘，胎盘娩出后，
无菌条件下2~4 h 将羊膜与绒毛膜分离，并将羊膜置于DMEM/F12 培养液内保存。羊膜上皮细
胞的原代培养应在羊膜取得后6 h 内进行。
原代HAECs 培养将5 cm×5 cm 大小的羊膜置于含有双抗(100 U·mL-1 青霉素、100 U·mL-1 链霉
素)的PBS 中反复冲洗3次。然后放入不加血清的 DMEM/F12 培养基中漂洗 3次。将漂冼后的
羊膜用眼科剪剪成数小块；再将组织块反复剪成1 mm×1 mm 大小。取 10 mL 羊膜组织悬液，
按1 4∶比例加入 0.25% Ⅱ的 型胶原酶，并置于37℃恒温振荡孵箱内消化2 h 后，1 000 r·min-1
离心5 min，吸出上清液(含胶原酶消化液)。再加入等体积0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA 室温下
消化15 min，用含10%胎牛血清的 DMEM/F12 培养基终止消化。1 000r·min-1 离心5 min，去
上清，用含10%胎牛血清的 DMEM/F12 培养基清洗后，将细胞悬液依次通过
100、200、300、400 目筛网过滤，细胞计数，然后将细胞以 1 × 107 个/mL 密度的 HAECs 悬
液2 mL 接种于 25 mL 培养瓶中，置5%CO2、37℃培养箱内培养。倒置显微镜动态观察细胞形
态变化及生长增殖情况。3 d 后首次换液，以后根据细胞生长情况，隔天换液，每次换液时去
除非贴壁细胞。待3~4 d 后细胞融合长满时，用 0.25% 胰蛋白酶消化，按1 2 ∶或1 3 ∶比例进
行传代，倒置显微镜观察，待细胞铺满瓶底时，重复上述操作。
原代HAECs 的鉴定取第3代HAECs 制作细胞爬片。常温下将细胞爬片用PBS 漂洗 3 min，×3
次；4%多聚甲醛固定10 min，PBS 漂洗 3 min，×3 次；0.2%TritonX-100 破膜20 min，PBS 漂
洗3 min，× 3 次；加入正常的山羊血清室温下封闭 30 min，PBS 漂洗 3 min，×3 次；加入鼠抗
人CK19(1 100)∶抗体和鼠抗人 vimentin(1 100)∶抗体，37℃孵育 2 h，PBS 漂洗 3 min，×3 次；
加入辣根过氧化酶标记的二抗，37℃孵育 30min，PBS 洗3min，×3 次；DAB 暗环境下显色；
自来水冲洗，苏木精复染2 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。倒置显微镜下
观察并摄像。对照组用 PBS 代替一抗。
不同浓度维甲酸诱导 HAECs 向神经样细胞分化 消化收集第3 代HAECs 制成细胞爬片，待细胞
生长至 60%~70% 融合时( 对照组用含10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培养基培养)，各维甲酸组去
除培养基，加入含不同浓度维甲酸的 DMEM/F12 诱导液(内含10%胎牛血清)。
实验分组 共分为 5组：①对照组，含10%胎牛血清的 DMEM/F12 培养基处理，不含维甲酸；
②1×10-8mol·L-1 维甲酸组[含1×10-8mol·L-1 维甲酸 DMEM/F12 培养基(含10％胎牛血清)]；
③1×10-7mol·L-1 维甲酸组[含1 × 10-7mol·L-1 维甲酸 DMEM/F12 培养基(含10%胎牛血清)]；
④1×10-6mol·L-1 维甲酸组[含1×10-6mol·L-1 维甲酸的 DMEM/F12 培养基(含10% 胎牛血
清)]；⑤ 1 ×10-5mol·L-1 维甲酸组[含1×10-5mol·L-1 维甲酸的 DMEM/F12 培养基( 含10% 胎牛
血清)]。每天换液，换液时去除非贴壁细胞，共诱导 7 d。
不同浓度维甲酸诱导 HAECs 分化后 Nestin 免疫组化染色
取出细胞爬片。常温下，将细胞爬片 PBS 漂洗 3 min，×3 次；4%多聚甲醛固定10 min，PBS 漂
洗3 min，× 3 次；0.2%TritonX-100 破膜20 min，PBS 漂洗 3 min，×3 次；加入正常的山羊血
清，室温下封闭 30 min，PBS 漂洗 3 min，× 3 次；加入兔抗人 Nestin 抗体(1 100)∶，37℃孵育
2 h，PBS 漂洗 3 min，×3 次；加入辣根过氧化酶标记的二抗，37℃孵育 30 min，PBS 漂洗 3
min，×3 次；DAB 暗环境下显色；自来水冲洗，苏木精复染2 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透
明，中性树胶封片。倒置显微镜下观察细胞并摄像，Nestin 标记的神经样阳性细胞呈棕褐色。
不同浓度维甲酸诱导 HAECs 分化后 MAP-2 免疫组化染色
取出细胞爬片。常温下，将细胞爬片 PBS 漂洗 3 min，×3 次；4%多聚甲醛固定10 min，PBS 漂
洗3 min，× 3 次；0.2%TritonX-100 破膜20 min，PBS 漂洗 3 min，×3 次；加入正常的山羊血清
室温下封闭 30 min，PBS 漂洗 3 min，× 3 次；加入兔抗人 MAP-2 抗体(1 100)∶，37℃孵育 2
h，PBS 漂洗 3 min，×3 次；加入辣根过氧化酶标记的二抗，37℃孵育 30 min，PBS 漂洗 3
min，×3 次；DAB 暗环境下显色；自来水冲洗，苏木精复染2 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透
明，中性树胶封片。倒置显微镜下观察细胞并摄像，MAP-2 标记的神经样阳性细胞呈棕褐色。
不同浓度维甲酸诱导 HAECs 分化后 GFAP 免疫组化染色
取出细胞爬片。常温下，将细胞爬片 PBS 漂洗 3 min，× 3 次；4% 多聚甲醛固定10 min，PBS
漂洗 3min，× 3 次；0.2%TritonX-100 破膜20 min，PBS 漂洗 3 min，×3 次；加入正常的山羊血
清室温下封闭 30 min，PBS 漂洗 3 min，×3 次；加入兔抗人 GFAP 抗体(1 100)∶，37℃ 孵育 2
h，PBS 漂洗 3 min，× 3 次；加入辣根过氧化酶标记的二抗，37℃孵育 30 min，PBS 漂洗 3
min，×3 次；DAB 暗环境下显色；自来水冲洗，苏木精复染2min，梯度乙醇脱水，二甲苯透
明，中性树胶封片。倒置显微镜下观察细胞并摄像，GFAP 标记的神经样阳性细胞呈棕褐色。
不同浓度维甲酸诱导 HAECs 分化过程中 Oct-4 免疫组化染色取出细胞爬片。常温下将细胞爬片
PBS 洗3min，×3 次；4% 多聚甲醛固定10 min，PBS 洗3 min，×3 次；0.2%TritonX-100 破膜
摘要：
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探讨维甲酸诱导HAEC在体外分化为神经样细胞的最适浓度来源：学术堂作者：姚老师发布于：2014-08-06共5810字目前，国内外研究多集中于干细胞向神经细胞分化的研究，而对体细胞的研究相对较少。干细胞存在伦理学、免疫排斥以及潜在的致瘤性等问题限制了其在临床上的应用，而具有部分胚胎干细胞特性的人羊膜上皮细胞(humanamnioticepithelialcells，HAEC)不存在上述问题，从而为细胞治疗提供了新的选择。HAEC是一种来源于人胎盘羊膜组织的上皮层体细胞。研究显示HAEC具有部分胚胎干细胞特性，即在体外培养下具有向3个胚层分化的潜能：内胚层(胰腺细胞、肝细胞)、中胚层(心肌细胞)...
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作者：闻远设计
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时间：2024-07-13
