小鼠骨片MSC分离与培养的方法

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小鼠骨片 MSC 分离与培养的方法

来源：学术堂作者：刘老师

发布于：2014-06-11 共4231 字

充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC) 是再生医学重要的种子细胞,在许多疾病治疗中呈现出

令人振奋的治疗效果.MSC 首先是由 Friedenstein 等[1-2]从骨髓中利用其贴壁生长的特性成功分

离出来. 这种方法后来被许多研究者用来分离人和实验动物来源的骨髓 MSC[3-6].小鼠是用量最

大、用途最广、品种最多的实验动物,已广泛应用于生物医学各领域的科学实验.然而令人烦恼

的是实验者很难成功的从小鼠骨髓分离到高纯度的 MSC, 或者很难实现 MSC 的连续多次体外传

代扩增培养[7].究其原因,是因为小鼠骨髓量很少,MSC 含量极少,同时混有大量造血细胞的优势

生长, 严重影响了 MSC 的分离培养[7].研究发现,MSC 存在于许多组织中[8],本研究将尝试从小

鼠骨片中分离 MSC,并建立其分离培养的方法.

材料与方法

一、材料

1. 实验动物 :C57BL/6 小鼠购自军事医学科学院动物实验中心,雄性,7 d 龄.所有实验在符合动物

实验伦理要求下进行.

2. 主要试剂及仪器 :αMEM 基础培养基( 美国 Gibco 公司),胎牛血清( 美国 Stem cell 公司),D-60

mm 细胞培养皿( 美国 Costar 公司),0.2 �胶原酶、β 甘油磷酸钠、地塞米松、胰岛素、1- 甲基 -

3 异丁基 - 黄嘌呤、吲哚美辛、维生素 C、油红 O( 美国 Sigma),碱性磷酸酶染色试剂盒(美国

Sigma),胰蛋白酶( 美国 Amresco 公司),PE、FITC 或PERCP 标记抗小鼠单克隆抗体

CD29,CD34,CD45,CD90,Scal1( 美国 BD 公司),CO2 培养箱( 美国 Thermo 公司),眼科镊,眼科剪.

二、方法

1. 小鼠骨片 MSC 分离培养 :C57 小鼠经脱颈处死后,75 � 酒精浸泡消毒 10 min.用眼科剪横向剪

开皮肤和肌肉,用眼科镊拨开露出小鼠胫骨和股骨,剥离胫骨和股骨,从胫骨头和股骨头处剪断,放

入预先放有培养基的培养皿中. 用1ml 注射器吸取基础培养基反复冲洗骨髓腔内的骨髓直至骨

片呈白色.将骨片剪碎, Ⅰ加入胶原酶 (2 mg/ml)2 ml,37℃ 消化1 ~ 2 h,加入胎牛血清终止消化. 加入

αMEM 洗涤骨片,将骨片转移到新的培养皿中, 加入新鲜配制的含胎牛血清 10 (v/v)� 和双抗0.1

(v/v)�的完全培养基,37℃、5 CO2� 培养箱培养 3 ~ 4 d. 加入0.25 � 胰酶消化3 min, 收获

MSC, 按1:3 传代培养,每2 ~ 3 d 更换培养基 1 次. 残留的骨片可继续培养获得更多的原代 MSC.

收获 P2,P3 代细胞进行实验研究.

2. 流式鉴定 : 收获 P2 代小鼠 MSC, 经PBS 洗涤 2 次, 加入PE、FITC 或PERCP 标记抗小鼠

CD29,CD34,CD45,CD90,Scal1 单克隆抗体避光孵育 30 min, 加入PBS 洗涤 2 次,1500 rpm 离心 5

min,重悬细胞,进行流式测定.FlowJ 7.6 软件进行数据分析.

3. 成骨诱导分化及鉴定 : 取P3 代小鼠MSC, 以每孔 2×104 细胞数种植于24 孔板中,60 ~ �

70 �融合时,更换为成骨诱导培养基, 含胎牛血清 10 (v/v),β � 甘油磷酸钠 10 mmol/L, 地塞米松

10-7mol/L, 维生素 C 50 μmol/L. 每3 ~ 4 d 更换培养基 1 次, 诱导 2 ~ 3 周后进行碱性磷酸酶染色鉴

定.步骤为吸弃培养基,4 � 多聚甲醛固定 30 min, 去离子水洗涤 2 次, 加入ALP 染料混合液,室温

孵育 30 min, 去离子水洗涤 2 次,每次2 min, 加入苏木素复染10 min,去离子水洗涤,倒置相差显微

镜下观察.

4. 成脂诱导分化及鉴定 : 取P3 代小鼠MSC, 以每孔 2×104 细胞数种植于24 孔板中,60 ~ �

70 �融合时, 更换含胎牛血清 10 (v/v),� 地塞米松 10-6mol/L, 胰岛素 10 ng/ml,1- 甲基 -3 异丁基 -

黄嘌呤 0.5 μmol/L, 吲哚美辛 10-4mol/L 的成脂诱导培养基, 每3 ~ 4 d 更换培养基 1 次,2 周后进行

油红 O 染色鉴定成脂细胞.步骤为吸弃培养基,PBS 洗涤 1 次, 加入4 � 多聚甲醛固定 30 min,70

� 异丙醇洗涤 2 次, 加入2 �油红 O 室温下染色 10 ~ 15 min, 弃去油红 O 染料,异丙醇洗涤残留

油红 O,倒置显微镜下观察细胞内脂滴.

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小鼠骨片MSC分离与培养的方法来源：学术堂作者：刘老师发布于：2014-06-11共4231字充质干细胞(mesenchymalstemcell,MSC)是再生医学重要的种子细胞,在许多疾病治疗中呈现出令人振奋的治疗效果.MSC首先是由Friedenstein等[1-2]从骨髓中利用其贴壁生长的特性成功分离出来.这种方法后来被许多研究者用来分离人和实验动物来源的骨髓MSC[3-6].小鼠是用量最大、用途最广、品种最多的实验动物,已广泛应用于生物医学各领域的科学实验.然而令人烦恼的是实验者很难成功的从小鼠骨髓分离到高纯度的MSC,或者很难实现MSC的连续多次体外传代扩增培养[7].究其原因,是因...

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