血管平滑肌细胞体外培养与诱导钙化研究

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血管平滑肌细胞体外培养与诱导钙化研究

来源：学术堂作者：朱老师

发布于：2016-11-17 共3779 字

血管平滑肌细胞（vascular smooth musclecells,VSMCs）是动脉发生钙化的主要细胞，最近

研究发现血管钙化类似于骨的形成，它是由细胞介导的主动调节过程，同时存在平滑肌细胞表

型转变，并与多个成骨相关类因子相关[1].以往体外研究动脉病变的平滑肌细胞主要来自动物

或人的主动脉[2],而对外周动脉的研究很少。血管平滑肌细胞是血管中膜的主要细胞成份，它

的钙化与血管的许多生物学行为有关。既往报道[3],VSMCs 体外培养后传代，其生物学特性仍

然接近体内细胞，以体外培养 VSMCs 为基础。模拟各种体内外干预条件，观察研究 VSMCs 的

细胞及分子生物学特性的改变，是研究心血管疾病发病机制的良好手段。本研究以酶消化法为

基础，总结一种方便、快捷、重复性高的分离、培养方法并进一步建立体外平滑肌细胞钙化诱

导模型，为外周动脉病变体外研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

DMEM 培养基（Hyclone 公司）、胎牛血清（Hyclone 公司）、DAPI 染液（Sigma 公

司）、DMSO,0.25%胰蛋白酶（上海碧云天公司）、一抗：α-SMA 单克隆抗体（Bioworld 公

司）、二抗：羊抗兔 FITC 标记二抗（武汉博士德公司）、山羊封闭血清（北京博奥森公

司）。

1.2 人股动脉 VSMCs 的体外培养

1.2.1 人股动脉分离及原代培养

取正常人股动脉，由中山大学附属医院血管外科王冕博士提供，取自于正常遗体捐献者。无菌

环境下手术刀片刮除外膜和内膜，将中膜平滑肌层分别剪成 1~2mm 大小的组织块，镊子逐个

贴在 25cm2 培养瓶上，培养瓶缓慢翻转，加入 20% 的胎牛血清含 100U/L 的青链霉素的

DMEM 培养液10ml,孵育在 37℃，5%的CO2 的培养箱中；2h 后轻轻翻转培养瓶，组织块被

充分覆盖。培养箱中孵育，2 周左右观察平滑肌细胞生长情况。

1.2.2 人股动脉平滑肌细胞的传代培养

将相互融合的原代培养的人股动脉 VSMCs,在换液后的 d3,弃去原培养液，用无菌的 PBS 轻轻

冲洗 3遍，用胰酶消化 1min 后，随即加入新鲜含10%胎牛血清的 DMEM 培养液终止消化，用

吸管反复吹打培养瓶 100 次，注意用力不能太大，否则细胞破碎。使细胞完全脱离瓶壁，镜下

计数：调整密度为1.0×105/ ml 的细胞悬液，吸取5ml 传入新的培养瓶中，每3d 换液1次，每

次换液量约 4ml, 待细胞长至融合状态后，可再传代。

1.3 人股动脉平滑肌细胞的鉴定

1.3.1 细胞形态学观察

将培养的平滑肌细胞置于倒置显微镜下，观察细胞贴壁、生长状况及形态并照相。

1.3.2 免疫荧光染色

（1）将平滑肌细胞接种在 13mm 直径圆形载长约40%~50%左右，吸取培养基，加 PBS 冲洗 3

次，每次 5min 左右；（2）加入 4%的多聚甲醛 4℃条件下固定15min,加入 PBS 冲洗 5min×3

次，之后用预冷CH3OH 洗3次；（3）预冷CH3OH -20℃通透平滑肌细胞 5min,PBS 再次冲洗

5min×3 次；（4）用10% 的山羊血清 5%BSA 封闭液室温封闭 20min,加入 1:150 小鼠抗人平滑

肌α-actin 单克隆一抗，4℃孵育过夜，次日室温复温1h;（5）加入 PBS 清洗5min×3 次，滴加

绿色荧光标记的羊抗小鼠二抗，室温避光孵育 1h,PBS 清洗5min×3 次；（6）DAPI 染液染细

胞核15min,dd H2O 清洗；（7）Mounting Medium 封片，荧光显微镜拍照，4℃ 避光保存。

1.4 冻存细胞

选融合度>90%的细胞；按传代方法用EDTA 把贴壁生长的细胞消化下来，反复吹打 100 次；

1000rpm 离心去上清，吸入离心管中。先用 DMEM 高糖培养基 8份+1 份胎牛血清+1 份二甲基

亚砜配成10%的细胞冻存液，混匀后吸管吸至 10ml 离心管中，然后吹打细胞，动作轻柔，使

细胞充分混匀。分装至 1.5ml 冻存管中。将细胞冻存管放入4℃冰箱30min,后置入-20℃冰箱2h

后，直接放入-80℃ 冰柜中。

1.5 钙化模型的建立

用钙化培养基（正常对照组的 DMEM 培养基中加入 10mmol / L β 磷酸甘油，10mmol / L 丙

酮酸）培养，2d 换液1次，连续培养 10d,以制备钙化的 VSMCs.

1.6 统计学方法

应用 SPSS 13.0 统计软件分析，组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA ）。

2 结果

2.1 原代平滑肌细胞培养（图1, 见插二）

组织块贴壁后1周，在倒置显微镜下观察，发现有细胞从垂直方向从组织块边缘迁移萌出（图

1A）；2 周左右当组织块中大部分细胞萌出后，组织块便脱离，其周围细胞密度更加增大，部

“分区域细胞相互接触交替生长，出现峰- ”谷结构（图1B）。平滑肌细胞从组织块的周围爬

出，随着时间的推移，4 “ ”周时，平滑肌细胞呈典型的峰谷状生长（峰：即多层细胞丘，可达

8~10 层，谷：即稀疏排列的单层细胞处，甚至无细胞处）（图1C ）。

随着传代次数的增多，平滑肌细胞生长周期逐渐缩短，五代以后维持在3~5d 左右，八代以后

维持在1~2d 左右，所以我们选用 3~8 代的细胞作为本实验的细胞。

2.2 平滑肌细胞的鉴定

如图 2（见封三）示，经过免疫荧光发现，细胞 SMα-actin 高表达，说明成功培养出平滑肌细

胞。

2.3 平滑肌细胞钙化模型的建立及鉴定

2.3.1 钙化斑块的形成（图3, 见封三）

正常培养见图 3上，钙化培养见图 3下。在普通培养基下，几乎不可见钙化斑块形成（白色光

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摘要：

血管平滑肌细胞体外培养与诱导钙化研究来源：学术堂作者：朱老师发布于：2016-11-17共3779字血管平滑肌细胞（vascularsmoothmusclecells,VSMCs）是动脉发生钙化的主要细胞，最近研究发现血管钙化类似于骨的形成，它是由细胞介导的主动调节过程，同时存在平滑肌细胞表型转变，并与多个成骨相关类因子相关[1].以往体外研究动脉病变的平滑肌细胞主要来自动物或人的主动脉[2],而对外周动脉的研究很少。血管平滑肌细胞是血管中膜的主要细胞成份，它的钙化与血管的许多生物学行为有关。既往报道[3],VSMCs体外培养后传代，其生物学特性仍然接近体内细胞，以体外培养VSMCs为基础。模...

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