研究轻、老龄红细胞表面Zeta电位的测量条件

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研究轻、老龄红细胞表面 Zeta 电位的测量条件

来源：学术堂作者：刘老师

发布于：2014-05-24 共3821 字

骨髓间充质干细胞是一类非造血干细胞，来源于中胚层，具有多分化潜能，具有自我更新能

力，易于分离培养，体外增殖能力强的特点。骨髓间充质干细胞在体内发挥调节免疫，减轻炎

症反应，组织再生，损伤修复，维持内环境稳态的作用.

在进行自体移植方面具有安全，无致瘤性，无组织配型和免疫排斥的问题，因而成为组织工程

与再生医学研究的焦点。种子细胞是组织工程的关键因素之一。骨髓间充质干细胞可以分化为

骨细胞，软骨细胞，肌腱，肌肉细胞，成纤维细胞，脂肪细胞，肝细胞，甚至神经元细胞。为

结缔组织等相关疾病中的骨、软骨、肌腱等的损伤修复提供了潜在的细胞来源，被认为是骨组

织工程中有价值的种子细胞.hMSCs 的成骨定向诱导可为骨组织工程技术治疗大段骨缺损提供

种子细胞，满足其在种子细胞数量和质量上的需要。实验通过全骨髓培养法分离 hMSCs,并用

诱导分化培养液做定向诱导培养，观察 hMSCs 向成骨细胞分化过程中的细胞形态学变化，进

行成骨细胞生物学表型鉴定以探讨 hMSCs 的培养方法、生长规律及向成骨细胞分化的条件。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1 试剂及细胞

培养基 α-MEM,0.25%胰蛋白酶-0.01%EDTA,L-谷氨酰胺，青霉素/链霉素双抗，胎牛血清

（FBS），Trizol 裂解液购自公司；四氮唑蓝（MTT ），茜素红 S,β-甘油磷酸钠，地塞米松和

维生素 C, 蛋白质裂解液 RIPA 购自 Sigma 公司；碱性磷酸酶活性检测试剂盒，购自 CellBiolabs

公司；逆转录试剂盒购自 Qiagen 公司，引物由 Invitrogen 公司合成；抗体

RUNX2,BMPR2,GAPDH 购自 Cell Signaling 公司。人骨髓间充质成体干细胞第一代传代细胞由

Gene Therapy 提供。

1.1.2 成骨诱导培养基

基础培养基（内含体积百分比为16.5%的胎牛血清+α-MEM+1%青霉素/链霉素+2 mM L-谷氨酰

胺），加入 20mM 的β-甘油磷酸钠，10nM 地塞米松，100μM 维生素 C 配制成成骨诱导培养

基。

1.2 方法

1.2.1 数量为 1× 的细胞接种于直径为10cm 的培养皿中，用含 16.5%FBS 的α-MEM 培养液，于

37℃，5%CO2,饱和湿度>95% 的CO2 培养箱中培养，3~4 天细胞达到 80% 融合时用0.25%胰蛋

白酶-0.01%EDTA 消化传代。根据实验需要重新接种在合适培养瓶或培养皿中。6 孔板中用于

钙结节染色分析，96 孔板中用于 MTT 实验和碱性磷酸酶（ALP）检测，10cm 直径培养皿用于

提取总 RNA 和蛋白质，分别用于 RT-PCR 和蛋白质印迹实验。诱导分化培养组（实验组）加

入诱导分化培养液，基础培养组（对照组）加入等量基础培养液，每3 天换液一次。

1.2.2 细胞观察

倒置相差显微镜观察体外培养细胞的生长、增殖、细胞形态变化及钙盐沉积。

1.2.3 细胞矿化作用检测用 4%甲醛固定细胞 min,1×磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，1%饱和茜素红

染色 30min, 观察细胞的形态和染色结果。

1.2.4 碱性磷酸酶（ALP ）活性测定采用StemTAG 碱性磷酸酶活性检测试剂盒测定 ALP 活性。

等描述的方法为先将细胞用预冷的1×PBS 冲洗，加入试剂盒中的细胞裂解液，4℃ 孵育 10min,

转入离心管内12 000 转/min 离心10min, 定量蛋白浓度，取50μl 裂解液转入96 孔板，加入

50μStemTAG 碱性磷酸酶活性测定底物，37℃孵育 20min, 加入 50μl 终止液。混匀 30s,以波长检

测吸光度 A 值。

1.2.5 骨钙素（OCN ）的测定

将细胞接种于 6 孔板内，诱导期末即（第 1,3,5,7,9,13,17,21 天）时，用 PBS 洗净孔内的培养

液，加裂解细胞，按试剂盒的说明书进行操作，抽提总RNA. 引物序列 OCN: 上游引物 5'GCA

AAG-3', 下游引物 5' CAG-3';β-actin: 上游引物 5'GAG CTG CG-3', 下游引物 5'ACA TGG-3'.β-actin

作为内参，设置无模板的阴性对照。使用Qiagen 试剂盒进行逆转录 cDNA 及RT-PCR,RT-PCR

反应在（Bio-Rad ）测定仪中进行。预变性 95℃ 5mn,PCR 循环条件为： 95 ℃，30 s;65 ℃，30

s;72 ℃，2 min, 共个循环，试验中 Ct 值进行三次重复检测。

1.2.6 蛋白质印迹实验

将6-孔板中培养不同时间点的诱导成骨细胞组和对照组细胞，用预冷的PBS 冲洗三遍，加入

细胞裂解液，超声处理 1min,10 000x g 离心5min.裂解的上清液进行蛋白质浓度定量。蛋白质

印迹实验按照 Cell signaling 公司说明书，6%~12%SDS-PAGE 电泳分离蛋白，电转膜100 伏

1h,5% （w/v）脱脂奶粉 20 溶液室温封闭非特异性抗体 1h, 一抗 RUNX2,BMPR2 和GAPDH 按

说明书 1:500~1 000 稀释，作为内参。印迹膜加入一抗 4℃孵育过夜，用 0.1%Tween 20 缓冲液

洗膜三次，每次 5min.印迹膜加入 antibody 二抗，孵育 1h, 用TBS/0.1%Tween 缓冲液洗膜三

次，每次 5min.在近红外成像系统 Infrared Imaging System（观察蛋白质印迹图像及光密度软件

定量分析条带灰度值。

1.3 统计学处理

实验数据均为三次独立实验的结果，数据用均数±标准差（standard deviation,SD）表示。组间

差异比较选用单因素方差分析One-Way ANOVA,统计软件为（SPSS 13.0 版本），以 a=0.05 为

检验水准，以（P<0.05）表明差异有统计学意义。RT-PCR 结果，应用公式-ΔΔ 法计算 OCN 表

达量与第一天比较升高的倍数，△β,ΔΔCt = Δ- Δ.

2 结果

2.1 倒置相差显微镜下所见人骨髓间充质干细胞 hMSCs 形态学观察，骨髓细胞接种于塑料培养

瓶后，细胞在培养瓶中散在分布，核呈圆形，椭圆形，核仁多而明显。24h 后细胞贴壁，贴壁

的细胞为单个，形态大部分呈梭形、三角形或纺锤形，培养天左右，细胞快速增殖，纤维细胞

样，放射状排列生长（图1 ）。

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研究轻、老龄红细胞表面Zeta电位的测量条件来源：学术堂作者：刘老师发布于：2014-05-24共3821字骨髓间充质干细胞是一类非造血干细胞，来源于中胚层，具有多分化潜能，具有自我更新能力，易于分离培养，体外增殖能力强的特点。骨髓间充质干细胞在体内发挥调节免疫，减轻炎症反应，组织再生，损伤修复，维持内环境稳态的作用.在进行自体移植方面具有安全，无致瘤性，无组织配型和免疫排斥的问题，因而成为组织工程与再生医学研究的焦点。种子细胞是组织工程的关键因素之一。骨髓间充质干细胞可以分化为骨细胞，软骨细胞，肌腱，肌肉细胞，成纤维细胞，脂肪细胞，肝细胞，甚至神经元细胞。为结缔组织等相关疾病中的骨、软骨、肌...

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