氧气葡萄糖剥夺刺激对星形胶质细胞谷氨酸释放的影响

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氧气葡萄糖剥夺刺激对星形胶质细胞谷氨酸释

放的影响

来源：学术堂作者：韩老师

发布于：2014-08-21 共4572 字

对脑梗死损伤机制的研究大多集中在缺血缺氧对神经元的影响，大量研究表明，缺血缺氧损伤

可诱导神经元大量释放谷氨酸，导致谷氨酸在细胞外液大量蓄积，引起谷氨酸的毒性作用，被

认为是脑梗死损伤的主要机制。而近年的研究表明，星形胶质细胞也能够释放谷氨酸，参与神

经系统的谷氨酸代谢。提示缺血缺氧损伤也有可能诱导星形胶质细胞释放谷氨酸，从而加重谷

氨酸的毒性作用。

本研究通过原代培养星形胶质细胞，采用氧气葡萄糖剥夺( oxygen glucose deprivation，OGD)

模型体外模拟缺血缺氧损伤环境，观察 OGD 刺激对星形胶质细胞谷氨酸释放的影响。此外，

由于连接子蛋白 43( connexin 43，Cx43) 半通道是星形胶质细胞释放谷氨酸的主要途径，本研

究还探讨了 Cx43 半通道是否参与了 OGD 诱导的谷氨酸释放。通过上述研究，以期探讨脑梗

死中枢神经系统损伤的机制，为脑梗死的临床治疗提供新的思路。

1 材料和方法

1 ．1 材料

胎牛血清 ( fetal bovine serum，FBS) 、DMEM 液为 Invitrogen 公司产品; 小鼠抗胶质纤维酸蛋白

( glial fibrillaryacidic protein，GFAP) 抗体及兔抗 Cx43 多克隆抗体均为 Sigma 公司产品; 兔抗 β-

Ⅲ微管蛋白( β-Ⅲ tublin) 抗体为 Promega 公司产品; 荧光二抗购自 Jackson 公司; Gap26 为

Severn Biotech 公司产品; Cx43 反义寡核苷酸( antisense oligodeoxynucleotide，ASODN) 由

Sangon Biotech 公司合成; 高效液相色谱仪购自 Waters 公司; 激光共聚焦显微镜购自 Lecia 公司;

新生大鼠购自解放军总医院第一附属医院实验动物中心。

1 ．2 方法

1 ．2 ．1 细胞培养培养方法参见文献［3］，具体方法如下: 取新生 1 d 的SD 大鼠，无菌取得

脑组织，分离血管和脑膜后，将脑组织剪成小块，1．25 g/L 胰酶消化后，用含 100 mL/L FBS

的DMEM 液终止消化，将细胞悬液种入预先铺有多聚赖氨酸的培养瓶中，密度为 2．0 ×105

个/cm2 ，于 37℃、50 mL/L CO2 培养箱培养，每 3 d 换液 1 次。10 d 后，在 37℃恒温摇床上

240 r / min 振荡24 h ，弃上清液。用 1 ．25 g / L 胰蛋白酶消化后种植入涂有多聚赖氨酸盖玻片

的24 孔培养板，种植密度 1 ．0 × 105 个/cm2。简要步骤如下: 多聚甲醛固定后，加入小鼠抗

GFAP 抗体( 1 1 500) ∶ 或兔抗 β-Ⅲ tublin( 1 1 000) ∶过夜; 而后加入 FITC 标记的抗小鼠 IgG 或

FITC 标记的抗兔 IgG( 1 500) ∶ ，结果显示，星形胶质细胞的含量＞90%，并且不含有神经

元。2 ～4 周传代后，星形胶质细胞用于实验。

1 ．2 ．2 实验分组和缺糖缺氧刺激星形胶质细胞随机分为 4 组: 正常对照组、OGD 刺激

组、Gap26( Cx43 半通道阻断剂) 联合OGD 刺激组、Cx43-ASODN 联合OGD 刺激组。对于

Gap26 联合OGD 刺激组，在刺激前，预先将星形胶质细胞与 300 μmol / L Gap26

( VCYDKSFPISHVR ) 共孵育 2 h; 对于 Cx43-ASODN 联合OGD 刺激组，同样预先将星形胶

质细胞与 Cx43-ASODN 共孵育 2 h。Cx43-ASODN 依据序列 5'-ACTC-CAGTCACCCAT-3' 而合

成，它可以有效的抑制Cx43 的表达。

缺糖缺氧损伤模型方法如下: 将星形胶质细胞培养 7 ～9 d 后，将培养基置换成不含糖和氧的培

养基，置于37℃ 、950 mL / L N2、50 mL/L CO2、饱和湿度的培养环境下培养。

分别培养 0、15、30、60、90、120 min。每一培养时段各设 6 个平行样本( n = 6) 。

1 ．2 ．3 细胞外液谷氨酸测定在每个刺激时间点，提取细胞培养液，离心 4 min 后，取上

清，采用高效液相色谱( highpressure liquid chromatography，HPLC) 来测定细胞外液谷氨酸浓

度。具体方法详见文献。

1 ．2 ．4 免疫荧光染色测定星形胶质细胞 Cx43 和GFAP 的表达情况各组细胞用 40 g/L 多聚

甲醛液固定 30 min( 室温) ，吸出固定液，0 ．01 mol/L PBS 洗3 次。星形胶质细胞培养孔中加

入小鼠抗 GFAP 单克隆抗体( 1 1 500) ∶ 和兔抗 Cx43 多克隆抗体( 1 1 500) ∶混合液，4℃过夜，

而后星形胶质细胞换为与第一抗体相应的结合了荧光素的二抗混合液，避光孵育 2 h，0 ．01

mol / L PBS 洗3 次后，800 mL / L 甘油封片，激光扫描共聚焦显微镜观察结果。

1 ．2 ．5 统计学分析各组数据以x ± s 表示，采用多个样本均数比较的方差分析及多重比较的

LSD-t 检验进行统计学分析。P ＜0 ．05 认为差异具有统计学意义。

2 结果

2 ．1 OGD 升高细胞外液谷氨酸浓度采用 HPLC 法，测定了不同时间点细胞外液的谷氨酸浓

度。结果发现，正常状态下( 0 min) ，细胞外液谷氨酸浓度大致为( 2 ．43 ±0 ．17) nmol/mL。

而OGD 刺激后，细胞外谷氨酸浓度逐渐升高，并在刺激 90 min 后，达到峰值，为( 5 ．00 ±

0 ．30) nmol/mL，显着高于对照组，差异有统计学意义( P ＜0 ．05) 。该结果表明，缺糖缺氧

刺激可以显着升高细胞外液谷氨酸水平，说明缺糖缺氧刺激可以促进星形胶质细胞释放谷氨

酸。【表1】

2 ．2 缺糖缺氧损伤诱导星形胶质细胞表达Cx43 蛋白在星形胶质细胞膜上，Cx43 蛋白构成

Cx43 半通道，是星形胶质细胞释放谷氨酸的主要通路之一。

本研究探讨了 OGD 刺激对细胞 Cx43 蛋白的影响。

通过免疫荧光染色发现，对照组Cx43 蛋白的平均荧光强度( mean fluorescence intensity，MFI)

为( 80 ±28) 自由单位 ( arbitrary unit，AU) 。OGD 刺激后，Cx43 蛋白表达的信号强度明显升

高，在刺激 60 min 后，其MFI 达峰值，为( 158 ．00 ± 43 ．00) AU，显着高于对照组( 图1) 。

说明OGD 刺激可诱导星形胶质细胞表达Cx43，为谷氨酸的进一步释放提供了通路。OGD 刺

激也能促进 GFAP 的表达，GFAP 的信号强度也明显升高，刺激 60 min 时，对照组为( 98 ．00

±24 ．00) AU; OGD 刺激组为( 170 ．00 ± 34 ．00) AU，说明缺糖缺氧刺激也激活了星形胶质

细胞。【图 1.略】

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氧气葡萄糖剥夺刺激对星形胶质细胞谷氨酸释放的影响来源：学术堂作者：韩老师发布于：2014-08-21共4572字对脑梗死损伤机制的研究大多集中在缺血缺氧对神经元的影响，大量研究表明，缺血缺氧损伤可诱导神经元大量释放谷氨酸，导致谷氨酸在细胞外液大量蓄积，引起谷氨酸的毒性作用，被认为是脑梗死损伤的主要机制。而近年的研究表明，星形胶质细胞也能够释放谷氨酸，参与神经系统的谷氨酸代谢。提示缺血缺氧损伤也有可能诱导星形胶质细胞释放谷氨酸，从而加重谷氨酸的毒性作用。本研究通过原代培养星形胶质细胞，采用氧气葡萄糖剥夺(oxygenglucosedeprivation，OGD)模型体外模拟缺血缺氧损伤环境，观察...

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