原代肝细胞常见的分离与培养方法综述

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原代肝细胞常见的分离与培养方法综述

来源：学术堂作者：周老师

发布于：2015-11-26 共4257 字

肝脏是体内功能最多且最复杂的实质脏器，主要功能包括参与物质代谢、胆汁的生成和排泄、

生物转化、分泌性蛋白质的合成、凝血物质的生成与消除，并在特异性和非特异性免疫中具有

重要作用[1].肝脏作为人体物质代谢的中心，在多种生理和病理过程中都发挥了重要的作用，

很多疾病也会累及肝脏。肝细胞作为肝脏内最主要的实质细胞类型，生理状况下占 80% ~ 90%,

行使了肝脏主要的功能，如参与内分泌调节、代谢多种营养物质、清除毒素、储存葡萄糖、合

成凝血因子和血清白蛋白及多种消化酶等[2].肝细胞属于上皮型细胞，体外培养后具有贴壁生

长的能力，长期稳定地大规模体外培养活力旺盛、形态和功能良好的肝细胞在肝细胞移植、基

因治疗、药物研发和药代动力学研究及药物毒性评价等方面具有非常广泛的用途[3-4].本文拟对

原代肝细胞常见的分离方法与培养方法做一综述。

　　 1　原代肝细胞的分离

肝细胞的分离方法有很多种，包括非灌流法和灌流法。非灌流法包括直接分离法、肝组织块外

植培养和酶消化法等；灌流法中的两步原位灌流法是普遍公认的经典分离方法，经此法分离出

的肝细胞产率高，存活率高，细胞维持肝细胞功能时间较长。

1.1 直接分离法

将动物麻醉或处死后，取出肝脏并剪成小块，通过挤压、剪碎、振荡、吹打等机械方法使肝细

胞从肝脏组织上脱落，得到单个肝细胞。也可与 EDTA 螯合法、灌注法相结合，即先用 EDTA

溶液进行充分灌流，再剪成组织小块，然后用研磨或剪切的方法分离获得肝细胞[5-6].此法的优

点是操作流程短，不需要昂贵的胶原酶和复杂的仪器，但此法得到的肝细胞数量较少，成活率

低。

1.2 肝组织块外植培养

1 ~ 3 天龄乳鼠经脱颈处死后，用碘酒酒精消毒腹部，然后迅速取出肝脏后置于培养皿中，将

肝组织剪成 1 mm3 左右的小块。用吸管吹打，待组织沉淀后吸出上清液，反复洗涤肝组织块，

最后加入含血清的培养基沉淀组织块。然后直接将肝组织块植入培养瓶中。开始时可加少量培

养基以免细胞块漂浮，置于37℃细胞培养箱中培养。也可在肝组织块用完全培养基沉淀后加入

IV 型胶原酶和 PVP 消化液于 4℃过夜。消化完全的组织块可用吸管吹打使其散开，在得到的

细胞悬液中加入血清，置于4℃一段时间后，换液去除浮于悬液中的血细胞及组织碎片，而多

数上皮细胞沉于管底。将细胞悬液离心后，加入完全培养基重悬后种于培养瓶中进行培养[7].

此法操作简单，肝细胞容易贴壁且可进行后续传代培养，但其影响因素较多，肝细胞密度不易

掌控且组织块能否游离出肝细胞无法确定。

1.3 酶消化法

包括胰酶消化法和胶原酶消化法两种。麻醉或处死动物后，将肝组织用缓冲液充分清洗，加入

胰酶或胶原酶消化完全，若此步骤中使用胰酶则需加入含血清的培养基终止其消化作用。之后

通过吹打等方法将肝细胞收集于培养基中，制备出单细胞悬液。

胰酶消化法操作简单，费用低，但分离的细胞数量有限、纯度较差，且胰蛋白酶消化的条件较

难掌握，所以现在应用较少。而胶原酶消化法则具有损伤较小、细胞产率高，细胞可在较长时

间内维持肝特异性功能等优点，但胶原酶价格昂贵，因此成本较高。除上述提到的直接胶原酶

消化法，现在此法多与灌流法相结合，包括半原位胶原酶灌流法以及下面即将阐述的经典的两

步原位胶原酶灌流法。

1.4 两步原位胶原酶灌流法

即Seglen 灌流法[8].将动物麻醉后，固定于超净台上，在无菌条件下打开腹腔，分离并结扎门

静脉，吸取肝脏灌流液从门静脉注入肝脏，后剪断下腔静脉，肝脏冲洗干净后，注入胶原酶缓

冲液进行消化。消化完成后，将肝脏剪下，研磨剪碎，加入培养基后多次离心，将沉淀置于

Percoll 分离液上层，离心后弃上清，沉淀的细胞用完全培养基重悬得到分离好的肝细胞悬液[9-

10].此方法分离培养出的肝细胞数量多、存活率高、形态好，能够较好的分离出肝实质细胞和

非实质细胞，且保留肝细胞的功能，是原代肝细胞分离培养的经典方法[11].但其操作流程复

杂，技术要求高，所需时间长，易污染，成本高，因此不易在一般实验室开展。现已有很多学

者对此法进行不断改良使其可以更广泛的应用。

2 原代肝细胞的培养

原代肝细胞的培养方法有很多种，包括单层培养法，双层培养法，微载体粘附培养法，球形聚

集培养法，微囊培养法和中空纤维培养法等[12-13] .在这里将主要介绍前三种较为常用且培养

效果较好的方法。

2.1 单层培养法

将分离出的细胞悬液接种于预先涂有胶原的培养皿中并置于细胞培养箱中培养，细胞贴壁后开

始增殖，并形成最初的一铺展层。肝细胞属于上皮细胞，体外培养后具有贴壁生长的能力。此

法操作简单，细胞形态和功能在短时间内可维持较高水平，且便于观察和应用于实验，因而目

前广泛应用于各实验室，但由于接触性抑制，不易进行大规模培养。而Tilles 等在平板载体中

添加产氧薄膜，从而增加肝细胞可附着的面积和培养体系中的氧含量，使肝细胞产量大大提

高，并延长了肝细胞维持功能的时间[14].

2.2 双层培养法

即胶原凝胶三明治培养法，是一种常用的三维细胞培养方法。先在培养皿底部铺入第一层胶

原，待其凝固形成胶原膜后加入分离好的细胞悬液，置于细胞培养箱培养；肝细胞贴壁后，再

加入第二层胶原，待其凝固后，在上面再加入培养液，形成多层结构[15].

该法为肝细胞提供了良好的环境，有助于维持细胞功能如合成分泌白蛋白、尿素等，并且细胞

生长状态良好，但胶原价格昂贵，且此法对于技术要求较高。

2.3 微载体黏附培养法

此法原理是在微载体间隙中加入新分离的肝细胞悬液，通过振动促使肝细胞黏附于微载体并进

行培养。将分离的肝细胞和微载体加入培养液中，使肝细胞附着到经胶原被覆的聚糖载体

（Cytodex3 或Biosilon 微载体）上进行培养[16].微载体为细胞提供了较大的贴壁生长表面积和

三维空间，微载体的悬浮状态可使细胞进行充分的物质交换，其支撑作用可维持肝细胞形态及

功能，可进行大规模培养。但细胞较易失去正常的分化功能，营养供给等理化因素可能对细胞

的增殖和存活产生影响，安全性有待确定，且此法操作步骤较多，如微载体需进行预先水化和

消毒，以及通过预实验来确定微载体的类型。

　　 3　问题与前景

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摘要：

原代肝细胞常见的分离与培养方法综述来源：学术堂作者：周老师发布于：2015-11-26共4257字肝脏是体内功能最多且最复杂的实质脏器，主要功能包括参与物质代谢、胆汁的生成和排泄、生物转化、分泌性蛋白质的合成、凝血物质的生成与消除，并在特异性和非特异性免疫中具有重要作用[1].肝脏作为人体物质代谢的中心，在多种生理和病理过程中都发挥了重要的作用，很多疾病也会累及肝脏。肝细胞作为肝脏内最主要的实质细胞类型，生理状况下占80%~90%,行使了肝脏主要的功能，如参与内分泌调节、代谢多种营养物质、清除毒素、储存葡萄糖、合成凝血因子和血清白蛋白及多种消化酶等[2].肝细胞属于上皮型细胞，体外培养后具有贴...

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