脂肪干细胞分离纯化方法的新研究成果

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脂肪干细胞分离纯化方法的新研究成果

来源：学术堂作者：姚老师

发布于：2015-08-29 共4374 字

脂肪干细胞（ adipose-derived stem cells ）来源于脂肪组织，取材方便、对自体损伤较小，具有

自我更新、多向分化能力、自体移植不发生排斥反应等特点，是组织工程中最有应用前景的种

子细胞之一。量很低，占 3%左右，并且分离出来的细胞纯度不理想[1].因此如何获得足够量

的、活性高的、高纯度的细胞极为重要。随着科研技术的不断发展，研究者提出了脂肪干细胞

不同的分离纯化方法。本文就近年来脂肪干细胞分离纯化方法的新研究进展作一综述。

1 脂肪干细胞分离方法

1. 1 组织块贴壁法

组织块贴壁法即将脂肪组织剪成适宜大小的组织块，然后将组织块贴壁到培养瓶中进行培养

[2].此法的核心是确保脂肪组织块贴壁，但在实际操作中很难保证每块组织块贴壁，尤其是在

换液过程中，组织块很容易漂浮，导致脂肪组织的浪费。

Jing W 等人[3] 采用组织块贴壁法分离培养 8 周龄 BALB/c 小鼠脂肪干细胞时，在脂肪组织剪碎

之前，先吸取脂肪组织表面附着的多余水分，将脂肪组织块接种到培养瓶后让组织块贴壁一段

时间后再加入细胞培养液，这样的处理可以使脂肪组织块更加牢固地贴在培养瓶上。本实验室

采用此法分离脂肪干细胞时将组织块接种到培养瓶后置于培养箱内培养 30 min 后再加入培养

液，使得组织块贴壁更加牢固[4].

1. 2 酶消化法

酶消化法为原代细胞培养常用的方法之一，原理是利用新鲜离体组织的细胞生物学特性未发生

明显的变化，仍具有二倍体遗传特性，通过消化液去除细胞间质，使细胞能够更好地吸收外界

营养和排出代谢产物，短时间内获得大量的活细胞。脂肪组织酶消化法即脂肪组织被剪成碎块

置于酶中消化，再通过过滤、洗涤和离心等步骤去除漂浮在上层的脂肪细胞和油脂，从而得到

脂肪干细胞。JiangA 等[5]通过酶消化法从人脂肪组织中分离出脂肪干细胞，所培养的细胞贴壁

生长、细胞形态为典型的长梭形成纤维样，表达脂肪干细胞特殊的表面标记物

CD29、CD44、CD105, 阴性表达造血干细胞相关的表面标记物 CD34、CD45.

酶消化法实际上是一种费时、昂贵的方法，尤其是在需要分离大量脂肪组织的时候，其弊端显

得更为突出；在酶的种类、浓度、消化时间上存在很大差异，缺乏统一的标准，大多数研究者

Ⅰ采用型胶原酶消化分离原代细胞[6], Ⅱ 少数采用型胶原酶[7]、IV 型胶原酶、VIII 型胶原酶

[8]、胰酶[9]或者胶原酶联合应用胰酶[10]进行消化分离，酶的使用浓度从 0. 05 ~ 2. 5 g/L 不等

[11 -14],消化时间范围为0. 5~ 3 h[15 -17],从而使得分离出来细胞的活性、表型、潜能存在一定

的差异；另一方面，市场上的胶原酶和胰酶纯度不高，可能包含有色素、内毒素、异种抗原、

异种蛋白酶体[18 -19]; 消化法获得的脂肪干细胞不纯；人为操作过多，容易造成污染；此

外，需要的脂肪组织量较大，当脂肪组织量较少时，采用此法无法扩增出足够量的脂肪干细胞

用于后续分析[20].

Griesche N 等[21]在常规胶原酶消化法分离脂肪干细胞的基础上作了一些改进，在消化获得的

细胞接种培养 60 min 后马上进行换液，与常规胶原酶消化法相比，此法可以明显减少

desmin、smA 和six2 的表达，提高干细胞标记物 nestin、oct-4 和sall-1 的表达。Carvalho PP 等

[22]使用临床级的无异源蛋白的释放酶消化人脂肪组织，消化获得的脂肪干细胞活性和功能与

Ⅰ 使用科研级的胶原酶、胶原酶 A 、胶原酶 NB4 相比无明显区别，表明高度纯化的释放酶可替

代科研级的胶原酶，减少酶中异源蛋白对脂肪干细胞的污染。Güven S 等[23] 使用 sepax 装置自

动分离脂肪干细胞，方法是将样品和胶原酶装入转移袋中，37℃ 孵育 1 h 后，转移袋与 CS-

490. 1 试剂盒相接，在 sepax 装置中启动 CS-490. 1 试剂盒开始自动消化，收集消化所得细胞，

此装置分离得到的脂肪干细胞比传统的手动消化法效率高、细胞产量高、人为干预少。胡金灵

等[24] 分离 SD 大鼠脂肪干细胞时采用 0. 25% Ⅰ 型胶原酶消化脂肪组织 30 min,离心，将获得的

细胞接种培养获得所需的细胞，此法提高了胶原酶浓度，缩短消化时间，可减少胶原酶对细胞

活性的影响；省略了传统胶原酶消化法中筛网过滤和红细胞裂解两个步骤，降低人为操作、试

剂对脂肪干细胞的损伤。

1. 3 其他方法

近几年来，除了传统的脂肪干细胞分离方法，还有些寻求突破的新方法出现。

1. 3. 1 吸附柱法

Ito K 等[25] 于2010 年首次使用由非织造织物组成的装置从骨髓中成功分离出间充质干细胞，

分离出来的细胞表达间充质干细胞细胞表型标记物，具有成脂成骨潜能。Doi K 等[26]参照上

述方法设计出一个由无纺纤维和聚乙烯织物组成的网格直径为100 μm 的吸附柱，此无纺纤维

和聚乙烯织物对贴壁细胞具有亲和力，具体方法是将抽脂产物的液体部分通过吸附柱，贴壁细

胞吸附到吸附柱中，再通过逆行流冲洗出吸附柱中吸附的细胞，获得的细胞接种培养，扩大的

细胞表达脂肪干细胞相关的表面标记物，具有向脂肪细胞与成骨细胞分化的能力，成功从抽脂

产物液体部分中分离出脂肪干细胞。此法可以避免酶的使用，但是仅适用于抽脂产物的液体部

分，而且需要大量的样品。

1. 3. 2 直接离心法

直接离心法的原理是通过离心收集吸脂时吸脂产物中混有的游离脂肪干细胞，将离心得到的脂

肪干细胞接种培养。Shah FS 等[27]将得到的吸脂产物用磷酸盐缓冲液洗涤，离心，分别收集

上层漂浮物和下层沉淀物，上层漂浮物加入磷酸盐缓冲液再次洗涤，离心，此过程重复3 ~ 4

次，将每次获得的下层沉淀物接种到培养瓶则可获得脂肪干细胞。

此法仅适用于吸脂手术获得的脂肪组织，并且需要大量的吸脂产物。

1. 3. 3 胶原酶消化法结合组织块贴壁法候晓琳等[28] 分离 C57BL/6J Ⅰ小鼠脂肪干细胞时将型胶

原酶消化获得的单细胞以及未消化完全的脂肪组织块一起接种到培养皿中，8 ~ 9 d 时细胞即铺

满皿底。此法将胶原酶消化法与组织块贴壁法两种方法有机结合起来，在短时间内适度消化降

低胶原酶对细胞活力损伤，同时把剩余未消化的脂肪组织块一起接种，可以充分利用脂肪组

Ⅰ织。不足之处是此法未与单独采用型胶原酶消化法、组织块贴壁法所获得的脂肪干细胞在细

胞产量、活性、分化潜能等方面进行比较。

2 脂肪干细胞纯化方法

为获得纯度较高的脂肪干细胞，目前有学者在分离的基础上结合相应的纯化方法，以获得研究

需要的细胞，现有的脂肪干细胞纯化方法如下。

2. 1 免疫磁珠分选法

免疫磁珠分选法分离纯化细胞的原理是基于细胞表面抗原与连在磁珠上相应的特异性单抗结

合，当单细胞悬液通过特定的外加磁场时，与磁珠相结合的细胞被吸附滞留在磁场中，未与磁

珠结合的细胞则不能被吸附在分选柱内，从而使细胞得以分离。免疫磁珠分选法将细胞生物

学、磁力学和免疫学等知识融于一体，具有高度特异性分选细胞的特点。Gierloff M 等[29]使

用免疫磁珠分离法从培养的大鼠脂肪干细胞中分离纯化出 CD29+、CD71+、CD73+、CD90+各

脂肪干细胞亚群，各干细胞亚群均具向脂肪细胞分化的能力，但是 CD29+干细胞亚群的成脂能

力强于CD71+、CD73+、CD90+各干细胞亚群。

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脂肪干细胞分离纯化方法的新研究成果来源：学术堂作者：姚老师发布于：2015-08-29共4374字脂肪干细胞（adipose-derivedstemcells）来源于脂肪组织，取材方便、对自体损伤较小，具有自我更新、多向分化能力、自体移植不发生排斥反应等特点，是组织工程中最有应用前景的种子细胞之一。量很低，占3%左右，并且分离出来的细胞纯度不理想[1].因此如何获得足够量的、活性高的、高纯度的细胞极为重要。随着科研技术的不断发展，研究者提出了脂肪干细胞不同的分离纯化方法。本文就近年来脂肪干细胞分离纯化方法的新研究进展作一综述。1脂肪干细胞分离方法1.1组织块贴壁法组织块贴壁法即将脂肪组织剪成适...

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