组织修复及再生医学中干细胞外泌体的应用研究

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组织修复及再生医学中干细胞外泌体的应用研

究

来源：口腔疾病防治作者：叶青松;胡凤婷;罗丽花

发布于：2020-02-13 共18129 字

　摘　　　　要：干细胞是一类具有高度自我更新以及快速增殖能力的未分化多能细胞。在特定的

条件下，干细胞可向人体其他组织细胞如骨骼肌细胞、心肌细胞、成骨细胞以及神经样细胞等

进行诱导分化。近年来，随着组织工程与再生医学的发展，干细胞作为优秀的种子细胞被广泛

应用于再生医学各个领域，但依然存在着移植后细胞存活率和再生能力下降、出现免疫排斥、

伦理监管等问题，因此很难普遍而安全地使用干细胞银行来进行再生医学应用。干细胞的旁分

泌作用自被发现以来，受到了极大的关注，越来越多的证据支持干细胞以旁分泌方式活动的观

点，尤其是外泌体的分泌对其生物学功能起着至关重要的作用。外泌体是一类纳米级胞外囊

泡，内含 RNA、蛋白质等生物活性分子，与干细胞有着相类似的功能，在细胞通讯、免疫应

答、修复组织损伤等方面有着不可忽略的作用。目前在骨/软骨组织修复、神经组织再生、肝

肾组织再生、肌肉组织修复、血管组织再生、味蕾再生、牙再生等领域也已开展了关于干细胞

外泌体在组织工程与再生医学方面的临床前期研究。本文将从外泌体的组成、形成释放、鉴定

等方面详细地介绍外泌体，并阐述不同干细胞来源的外泌体在组织工程与再生医学中的研究现

况，对其广阔的应用前景进行展望。

　　关键词：干细胞; 外泌体; 胞外囊泡; 组织工程; 再生医学; 骨再生; 软骨再生; 牙再生; 血

管再生; 临床前研究;

Abstract： Stem cells are a class of undifferentiated cells with high self-renewal and rapid

proliferative capabilities.Undercertain conditions,stem cells can induce differentiation into other tissue

cells of the human body,such as skeletal muscle cells,cardiomyocytes,osteoblasts,and nerve-like

cells.In recent years,with the development of tissue engineering and regenerative medicine,stem cells

have been extensively used in various fields of regenerative medicine as optimal seeded

cells;however,there are still some problems,such as the decreased cell survival rate and regenerative

capacity after transplantation,immune rejection,and ethical supervision.Therefore,it is difficult to

universally and safely use stem cell banks for regeneration applications.The paracrine effect of stem

cells has been extensively studied since its discovery.Increasing evidence supports the view that stem

cells act in paracrine manner,and the secretion of exosomes plays a vital role in their biological

functions.Exosomes are nanoscale extracellular vesicles containing biologically active molecules such

as RNA and proteins;they possess similar functions to stem cells and play important roles in cell

communication,immune response,and repair of tissue damage.At present,clinical studies on stem cell

exosomes in tissue engineering and regenerative medicine have also been carried out in the fields of

bone and cartilage repair,nerve tissue regeneration,liver tissue regeneration,skeletal muscle tissue

engineering,vascular regeneration,taste bud repair,tooth regeneration,etc.In this paper,the

composition,formation,release and identification of exosomes are introduced in detail.The research

status of exosomes from different stem cell sources in tissue engineering and regenerative medicine is

described,and their broad application prospects are discussed.

　　 Keyword： stem cells; exosomes; extracelluar vesicles; tissue engineering; regenerative

medicine; bone regeneration; cartilage regeneration; tooth regeneration; angiogenesis; preclinical

study;

外泌体是一类包载有生物活性分子如脂类、核酸、蛋白质等的膜性囊泡，直径大小约为 30～

100 nm，是已知的最小的胞外囊泡[1]。外泌体可由绝大多数类型的细胞分泌产生，如肿瘤细

胞、内皮细胞等；亦可存在于血液、脑脊液及乳汁等体液中[2]。外泌体的功能主要有赖于其来

源细胞的类型，可参与细胞通讯、免疫应答、抗原呈递、RNA 及蛋白质转运[3]以及肿瘤侵袭

[4,5]等多方面的调控作用。干细胞因来源丰富、取材简便安全、低免疫原性等优点已被作为种

子细胞在组织工程和再生医学领域得到广泛关注，且其与外泌体相关的作用机制已成为当前研

究的重点和热点。目前，大量研究证明，干细胞主要经旁分泌作用，尤其是外泌体来介导干细

胞的生物学功能并诱导其向多种类型细胞进行分化[6,7]。干细胞来源的外泌体具有与干细胞相

近的功能，如促进组织修复和再生等；同时，利用外泌体治疗又可以规避干细胞移植的风险，

如免疫排斥反应、干细胞再生能力降低、致瘤性等[8,9]。因此，干细胞外泌体有可能成为干细

胞疗法在组织修复及再生医学研究领域中有前景的一种替代疗法。

　 1 　、外泌体的组成及生理作用

蛋白质在外泌体内容物中的占比较大且种类多样，主要分为两大类，一类是普遍存在于外泌体

表面或内腔中并参与其结构构成的蛋白质，包括骨架蛋白、膜转运和融合相关蛋白、热休克蛋

白、四跨膜蛋白超家族成员以及多泡小体形成相关蛋白等；另一类是具有一定的特异性，并与

其细胞来源有关的蛋白，如富含主要组织相容性复合体-Ⅰ、CD80 相关蛋白的血小板来源外泌

体；富含转化生长因子-β、凋亡相关因子配体相关蛋白的肿瘤细胞来源外泌体等[10]。

外泌体区别于其他生物囊泡的一大特征就是含有大量的核酸如双链 DNA(dsDNA）、信使

RNA(mRNA）、微小RNA(miRNA）、转运 RNA(tRNA）以及长非编码 RNA(LncRNA）等

[11]。近年来，一些研究证明miRNA 与疾病的发生发展、转归有着密不可分的关系。Cheng 等

[12]发现肿瘤来源的外泌体分泌产生的生物标志物microRNA-146a-5p 可促进肿瘤的发生；Cui

等[13]证实了外泌体 miRNA-224 作为一种肿瘤启动子，与肝细胞癌的发生发展有着密切的联

系，并且可作为肝细胞癌患者诊断和预后的指标；Hunsaker[14]等研究发现口腔癌外泌体中

miR-21、miR-155 等的表达水平可以用作评价相关抗肿瘤药物的作用机制和途径。此外，由于

外泌体中的 miRNA 体积小，又能避免RNA 酶的降解，因此，可以较长时间稳定地存在于体

内，使得外泌体 miRNA 已成为一种理想的疾病诊断和预后生物标记物。除了辅助癌症诊断之

外，外泌体 miRNA 在心血管疾病等慢性疾病上也起着同样的作用[15]。外泌体的这些生理作用

对于其在再生医学领域，如骨组织再生等的应用，也有着密切的关联性[16]。

外泌体具有脂双层结构，含有丰富的胆固醇、鞘磷脂、磷脂等，并含有一些功能性的脂类酶。

同时，外泌体所含的脂质种类因其来自不同的细胞而会有一定的区别[17]、这些脂质分子不但

可以保持外泌体正常的外形结构，而且可以参与多种生物学活性过程，如激发钙内流、调节外

泌体分泌等[18]。

　 2 　、外泌体的形成与释放

多种类型的细胞均可产生并分泌外泌体，同时外泌体也广泛存在于体液中，如血液、母乳、腹

水等；并存在于大多数细胞的培养基中[19]。早期外泌体通过非网格蛋白或网格蛋白介导的内

吞作用而形成，其形成释放过程是母细胞在刺激作用下如 DNA 损伤、缺氧等[20]，将颗粒状物

质包裹到质膜后内陷形成多泡小体（multivesicular bodies,MVBs），然后多泡小体与母细胞质

膜上的特定部位融合形成芽泡，最后母细胞将形成的芽泡以外泌的形式释放到细胞外[21]。迄

今为止，外泌体的形成与释放机制尚未完全了解，已知的内体分选复合体（endosomal sorting

complexes required for transport,ESCRTs）在外泌体的形成、分选和分泌过程中担任着一个关键

角色，是一种多蛋白复合物，可分为 ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ、ESCRT-Ⅲ。另外，相

关研究表明，ESCRT-非依赖性途径也参与了外泌体的分泌[22]，在 ESCRTs 四个亚单位同时沉

默的情况下，MVBs 仍可以产生。

外泌体以出芽方式释放到胞外后，可以通过旁分泌和内分泌两种方式作用于受体细胞[23]，并

通过交换遗传信息和（或）调控某些基因表达，参与调节受体细胞的各种生物学过程[24]，最

终达到改变靶细胞的表型和（或）遗传型的效果。同时，靶细胞内化外泌体的途径各式各样

[25,26]，如胞吞作用、配体-受体作用以及与目标细胞细胞膜直接融合等。

　 3 　、外泌体的富集与鉴定

目前，从细胞培养基或体液中富集外泌体的方法有多种，如超速离心法、密度梯度离心法、免

疫磁珠法、试剂盒提取法等。超速离心法作为外泌体提取的金标准，其操作简便、产量高、不

易被污染，但提取到的外泌体常含有凋亡小体等杂质，存在纯度不高等缺点；经密度梯度离心

法获取得到的外泌体综合产量好且较纯，但操作流程异常繁琐、费时费力；采用免疫磁珠法提

取的外泌体特异性高，但对产品的要求严格、产量不高；试剂盒法则操作简便、产量高且工作

效率高。随着对外泌体的研究越来越多，一些新的收集方法也相继被研发出来，包括纳米横向

位移阵列[27]，纳米定侧位移（nano-deterministic lateral displacement,nanoDLD)[28]和聚乙二醇

法[29]等。其中，nano-DLD 技术可以根据外泌体的大小对其进行分析、分类和收集，该方法具

有良好的生物学功能，便于单颗粒外泌体的分析，不需要特殊标记，样本量小，且无破坏性

[29]。聚乙二醇法是由一种病毒分离法演变而来，先采用低速离心法富集外泌体，再以超速离

心法进行进一步的纯化。Rider 等[29]采用该方法提取了外泌体并进行检测，发现总蛋白和核糖

核酸在量和质上足以满足蛋白质组学和测序分析的要求，证明了这种分离方法在生物标记物和

诊断中的应用；同时，该方法对外泌体的生物学活性没有负性作用。

外泌体的鉴定主要根据形态、体积大小以及表面标记蛋白来进行检测，电子显微镜检测、纳米

粒子示踪分析[30]、流式细胞术[31]、蛋白质印迹法[32]和酶联免疫吸附试验等都是常用的检测

手段。电子显微镜是最常用的鉴定方法，通过扫描电子显微镜以及透射电子显微镜可直观地认

识外泌体的表面及内部结构；此外，外泌体携带的蛋白质均可通过流式细胞术、蛋白质印迹法

和酶联免疫吸附试验等进行检测。

　 4　、外泌体的优点

　　 4.1 　、外泌体来源丰富、收集简便

外泌体来源丰富且产量高，多种类型的细胞均可产生并分泌外泌体，且每个细胞平均能产生 1

000～10 000 个外泌体。通过超速离心法等方法可从各种体液或培养基中提取外泌体；同时，

也可以通过特制的细胞株进行大规模的生产外泌体。相比干细胞而言，外泌体的获取方法极为

简便，大大节省了提取和扩增干细胞的成本和时间。

　 4.2 　、外泌体稳定性高、可长期存储

外泌体体积约是干细胞的百万分之一，复杂性更低，且其结构稳定，不易被分解，易于生产和

存储。当前研究[30]发现-20℃保存1周以内对外泌体并无影响，而-80℃条件下外泌体则可长

期储存，且外泌体的活性可长期维持。

　 4.3　、外泌体具有更好的安全性、可规避干细胞治疗风险

目前，基于干细胞的治疗方法存在移植后的干细胞生存率和再生能力下降、出现免疫排斥反应

“ ”等问题。以外泌体作为治疗因子的无细胞疗法则可以避免上述可能出现的问题，由于外泌体

膜结合蛋白含量较低，即使是在同种异体给药后出现免疫排斥的可能性也非常低[2]。另外，外

泌体不具备增殖分裂能力，所以不存在形成肿瘤的可能性。因此，外泌体在临床应用过程中比

干细胞具有更好的安全性。

4.4 、外泌体是一种理想的载体

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组织修复及再生医学中干细胞外泌体的应用研究来源：口腔疾病防治作者：叶青松;胡凤婷;罗丽花发布于：2020-02-13共18129字　摘　　　　要：干细胞是一类具有高度自我更新以及快速增殖能力的未分化多能细胞。在特定的条件下，干细胞可向人体其他组织细胞如骨骼肌细胞、心肌细胞、成骨细胞以及神经样细胞等进行诱导分化。近年来，随着组织工程与再生医学的发展，干细胞作为优秀的种子细胞被广泛应用于再生医学各个领域，但依然存在着移植后细胞存活率和再生能力下降、出现免疫排斥、伦理监管等问题，因此很难普遍而安全地使用干细胞银行来进行再生医学应用。干细胞的旁分泌作用自被发现以来，受到了极大的关注，越来越多的证据支持...

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