分析不同pH下重组蛋白R1R2和R1R2CT二级结构特性

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分析不同 pH 下重组蛋白 R1R2 和R1R2CT 二

级结构特性

蜘蛛丝拥有优异的机械和生物学性能，是一种理想的多功能材料。由于蜘蛛自相捕食和产丝量

小等，通过驯养蜘蛛获取大量蛛丝纤维的难度较高，因此采用生物技术的方法重组表达蜘蛛丝

蛋白成为获取仿生蜘蛛丝纤维的主要途径。

到目前为止，在蛛丝仿生领域仍未取得突破，仿生的拟蛛丝纤维性能远不及天然蛛丝。研究表

明蛛丝蛋白的高分子量特性和成丝模式是决定丝纤维性能的重要因素，现已成为研究的热点。

典型的蛛丝蛋白由氨基端(N terminal，NT)、羧基端(C terminal，CT)以及占到>90%的重复区

(Re－peat，R)构成。NT 和CT 高度保守，在蛛丝蛋白的分泌、储存和成丝等过程中起重要的

调节作用。

随着 pH 的降低(中性到酸性)，NT 二聚化，形成蛋白网络；CT 则能促进蛛丝蛋白的排列和可

溶性的提高等，具体功能尚不清楚；R 主要与蜘蛛丝性能相关。另外，蛛丝蛋白纤维化还受到

盐离子的影响，如氯化钠能够维持主壶腹腺丝蛋白(major ampullate spidroin，MaSp)NT 单体的

稳定性等。由于主壶腹腺体容易分离，分泌的主壶腹腺丝性能突出等优点，长期以来一直受到

青睐。

2012 年本课题组获得首条次壶腹腺丝蛋白(Minorampullate spidroin，MiSp)全长编码序列，经比

对分析得知 MiSp 和MaSp 的CT 同源性较高，但 MaSp CT 含有两个保守半胱氨酸(Cysteins)，

通过二硫键相互作用，形成平行二聚体；MiSp CT 则没有 Cys，二聚化机制和生物学功能尚未

得到充分证实。

为了进一步研究蜘蛛丝蛋白 MiSp 重复区 R 和羧基端 CT 的二级结构和功能，本实验通过克隆

并在大肠杆菌 Rosetta 2(DE3)中分别表达 R1R2CT 和R1R2 两个组合模块蛋白，借助 Ni-NTA 亲

和色谱纯化，利用圆二色谱(circular dichroism，CD) 测定并分析了不同 pH 条件下的重组蛋白

R1R2 和R1R2CT 二级结构特性；采用扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM) 表

征R1R2 和R1R2CT 重组蛋白在不同 pH 及离子条件下的聚集和成丝情况，为成丝机理的研究

奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

质粒抽提试剂盒、DNA 胶回收试剂盒均购自上海生工生物工程有限公司；

EcoRⅠ、HindⅢ、BsaⅠ 限制性内切酶和phusion High-Fidelity PCRMM buffer 购自NEB 公司 (美

国)；T4 DNA 连接酶购自Fermentas 公司 (美国)；6×his 抗体购自天根公司；Ni-NTA 树脂购自

Qiagen 公司(德国) 。

1.2 方法

1.2.1 克隆构建

以MiSp 全长基因为模板(GenBank 登录号:

JX513956) ，以 R1p1 和R1p2 为引物PCR 扩增 R1 ，以 R2p1 和R2p2 为引物PCR 扩增

R2。BsaⅠ 酶切 R1 和R2 ，酶切片段回收后由T4 连接酶体外连接 R1 和R2；以连接产物为模

板，以 R1p1 和R2p2 为引物扩增 R1R2；R1R2 由EcoRⅠ 和Hind Ⅲ 酶切，胶回收后的酶切片段

与拥有相同酶切位点的载体连接。以 R1R2 为模板，以 R1R2p1 和R1R2p2 为引物扩增片段

R1R2 ，以 CTp1 和CTp2 为引物扩增 CT；R1R2 和CT 分别由 BsaⅠ 酶切，酶切片段回收后体外

连接，连接产物用作模板，以 R1R2p1 和CTp2 为引物扩增 R1R2CT ，产物经 EcoRⅠ 和HindⅢ

酶切后与载体连接，引物序列见表1 ，具体克隆构建过程如图1 。

1.2.2 融合蛋白的表达

将测序正确的重组质粒转化于 Rosetta 2(DE3) 感受态细胞。挑取单克隆接种于 5 mL LB 培养基

( 含卡那霉素30 mg/L)。200 r/min，37 ℃ 过夜培养。将5 mL 过夜培养物接种于 500 mL 新鲜

LB 培养基 ( 含卡那霉素30 mg/L)，37 ℃ 震荡培养至OD600 为0.9 左右，温度降至25 ℃时加入

终浓度为 0.3 mmol/L 的IPTG，25 ℃ 诱导培养4 h ，离心10 min (8 000 r/min，4 ℃)收集菌体，

加入 30 mL20 mmol/L Tris pH 8.0 重悬菌体，200 W 超声破碎( 超声 5 s ，间隔 8 s)60 次，低温高

速离心30 min(12 000 r/min，4 ℃) 收集上清。

1.2.3 蛋白表达产物纯化和分析

上清中重组蛋白与 Ni-NTA 结合，由含有 50mmol/L 咪唑的20 mmol/L Tris pH 8.0 进行完全洗

涤，最后由含有 300 mmol/L 咪唑的20 mmol/LTris pH 8.0 洗脱蛋白。纯化过程中，收集穿柱液

(Flow through)、洗涤液(Wash)、洗脱液(Elution) ，并各取出 20 μL ，加入 5 μL 的5X SDS-PAGE

上样缓冲液，100 ℃ 水浴 10 min ，取适量样品经12%SDS-PAGE 电泳后进行染色和脱色分析。

样品经12% SDS-PAGE 凝胶电泳后进行恒流电转移，转移到PVDF 膜，以 6×his 组氨酸标签作

为检测抗原，对表达的融合蛋白进行 Western blot 来进一步检测，具体方法参照 Invitrogen 操

作手册。

1.2.4 重组蛋白二级结构测定

实验中采用 CD 测定所有蛋白的二级结构，均使用上海交通大学分析测试中心的JASCO J-815

圆二色谱仪。终浓度为 0.1 g/L 的重组蛋白 R1R2 和R1R2CT 分别溶于 pH 5.5、6.5 和7.5 的

PBS 磷酸盐溶液中，从190～260 nm 的波长范围收集信号，测试所用比色皿大小为 1 mm 。

1.2.5 扫描电子显微镜测试分析

终浓度为 10 μmol/L 的重组蛋白 R1R2 和R1R2CT 分别溶于 6 种不同 pH 和盐离子的溶液中: 20

mmol/L PBS pH 5.5、20 mmol/L PBS pH 6.5、20 mmol/L PBS pH 7.5、20 mmol/L PBS pH 5.5(含

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摘要：

分析不同pH下重组蛋白R1R2和R1R2CT二级结构特性蜘蛛丝拥有优异的机械和生物学性能，是一种理想的多功能材料。由于蜘蛛自相捕食和产丝量小等，通过驯养蜘蛛获取大量蛛丝纤维的难度较高，因此采用生物技术的方法重组表达蜘蛛丝蛋白成为获取仿生蜘蛛丝纤维的主要途径。到目前为止，在蛛丝仿生领域仍未取得突破，仿生的拟蛛丝纤维性能远不及天然蛛丝。研究表明蛛丝蛋白的高分子量特性和成丝模式是决定丝纤维性能的重要因素，现已成为研究的热点。典型的蛛丝蛋白由氨基端(Nterminal，NT)、羧基端(Cterminal，CT)以及占到>90%的重复区(Re－peat，R)构成。NT和CT高度保守，在蛛丝蛋白的分泌、储...

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