近20余年膜蛋白质组的研究成果综述

3.0 闻远设计 2024-04-20 6 4 32.06KB 9 页免费

侵权投诉

近20 余年膜蛋白质组的研究成果综述

　摘　　　　要：　生物膜是一类重要的亚细胞结构，含有大量的跨膜蛋白和非跨膜蛋白，负责细胞

与外界的物质和信息交换以及行使细胞内的多种功能。鉴定并分析膜蛋白在生物膜上的表达是

研究其功能必不可少的步骤。蛋白质组学技术可以在单次实验中一次性从全细胞裂解物中鉴定

多达上万个蛋白质，从而为分析这些蛋白的表达提供了直接的证据。但由于膜蛋白具有较强的

疏水性，从而导致对膜蛋白的蛋白质组学鉴定相对困难，这也使得对膜蛋白的结构与功能的研

　究进展相对比较缓慢。随着鸟枪法蛋白质组学 (shot-gun　proteomics)　　及滤膜辅助的样品制备

(filter　aided　sample　preparation)　等为代表的现代蛋白质组学技术的快速发展，膜蛋白的鉴定水平

及覆盖率也随之大幅提高。本文主要综述了过去 20 余年在膜蛋白质组学技术上的重要进展，

　并以光合作用模式蓝藻集胞藻 (Synechocystis　sp.PCC6803)　的膜蛋白质组学研究为例，阐述了技

术的进步如何提高膜蛋白鉴定的覆盖度，以期为其他物种膜蛋白质组全覆盖度的鉴定提供相应

理论借鉴。

　　 Abstract：　 Membrane　proteins　play　important　functions　not　only　as　receptors　and　transporters,　

but　also　in　many　other　important　intracellular　functions　such　as　photosynthetic　and　respiratory　electron

transport.　Identification　of　membrane　proteins　is　a　necessary　step　to　understand　their　functions.　

Membrane　proteins　are　generally　highly　hydrophobic　and　difficult　to　be　resolved　by　aqueous　solutions,

and　large-scale　proteomic　identification　of　membrane　proteins　has　been　a　great　technical　challenge.　

Significant　efforts　have　been　invested　in　the　field　to　improve　the　solubility　of　membrane　proteins　in　

aqueous　solutions　that　are　compatible　for　mass　spectrometry　analysis.　This　review　summarizes　the　

main　technological　achievements　in　the　field　of　membrane　proteomics　particularly　for　the　

improvement　of　membrane　protein　identification,　and　uses　the　photosynthetic　model　cyanobacterium　

Synechocystis　sp.　PCC6803　as　an　example　to　illustrate　how　technology　advances　push　forward　the　

field　in　terms　of　the　increased　coverage　of　membrane　proteome　identification.

　 Keyword：　 membrane　protein;　proteomics;　hydrophobicity;　cyanobacterium;

生物膜主要由磷脂双分子层和镶嵌或附着在其上的蛋白质构成。动物、植物和微生物通常都有

　一种或多种膜系统。细胞质膜 (质膜)　是最为常见的一种膜系统，负责把细胞质和其他内溶物与

周围环境分隔开，并负责与环境交换物质和感受信号。除质膜外，细胞内还有多种内膜系统，

如高尔基体、线粒体、叶绿体等都有一层或多层膜状结构。叶绿体的膜系统分为被膜和类囊体

膜，由外膜和内膜构成的被膜主要的作用是起到将叶绿体的内溶物与细胞质分开，并负责细胞

质与叶绿体之间的物质和信息交换。类囊体膜则是光合作用的主要场所，光合电子传递链中的

Ⅰ Ⅱ所有蛋白质复合体都定位于类囊体膜上，包括光合系统、光合系统、细胞色素 Cyt　b6f 复合

物以及 ATP 　合酶复合物 (图1)　。

膜蛋白质是生物膜的重要组成成分，在物质运输和信号转导的过程中发挥着关键作用。据预

测，一个物种的基因组所编码的蛋白有 30%是膜蛋白[1,2]。由于膜蛋白具有一些特殊的氨基酸

组成并由此产生强疏水性，从而导致对膜蛋白的蛋白质组学鉴定要远远难于可溶性蛋白，这也

　使得对膜蛋白的结构与功能的研究进展相对较为缓慢。本文以一种光合作用模式蓝藻集胞藻

(Synechocystis　sp.PCC6803)　为例，介绍了膜蛋白的生物化学特征以及膜蛋白质组学相关技术，

综述了过去 20 余年膜蛋白质组的研究进展，着重阐明了技术的进步如何在提高膜蛋白质的鉴

定效率及覆盖度。

1 　、膜蛋白生物化学特征及分离纯化方法

　　　 1.1 　、膜蛋白的生物化学特征

由于膜蛋白质在功能上的重要性以及在解析膜蛋白质组上存在的巨大技术挑战，从蛋白质组学

学科出现开始，膜蛋白质的分离和鉴定就成为了蛋白质组学研究的一个焦点方向。膜蛋白质的

研究之所以具有巨大的技术上的挑战性，最主要的原因是由于其高于一般蛋白质的疏水性。整

　合膜蛋白质 (integral　membrane　protein,　IMP)　　一般都通过一个或多个跨膜结构域(transmembrane　

domain,　TMD)　而整合在膜上，跨膜结构域大小一般在20 个氨基酸残基左右，主要由疏水氨基

　酸组成，可以和膜的重要组成成分 (磷脂双分子层)　发生疏水相互作用，从而将蛋白质固定到膜

上[3,4]。除了 IMP 　，生物膜通常还含有大量的周边膜蛋白 (peripheral　membrane　protein,　PMP)

。PMP – 　不含跨膜结构域，与膜的结合主要是通过蛋白质蛋白质或者蛋白质与脂类的相互作用

(图1)　。有些蛋白质还会发生翻译后修饰，并通过修饰集团与膜的相互作用而结合到膜上。常

见的化学修饰主要有磷酸肌醇修饰、粽榈酰化、豆蔻酰化等。蛋白质与膜的相互作用一般可以

分为共价和非共价两种类型。共价相互作用非常稳定，磷酸肌醇修饰的蛋白与膜的结合可以看

作是一种共价的结合，结合非常稳定，很难从膜上被分离[5,6] –。而很多蛋白质蛋白质之间的

相互作用通常是非共价的，包括氢键、静电相互作用、疏水相互作用以及范德华力等。这些非

共价的相互作用可以介导蛋白质形成复合体。通常很多PMP 通过和一个或多个 IMP 共同形成

复合体而结合在膜上。PMP 与膜的结合一般是可逆的，其结合稳定度通常随细胞内微环境的变

化而变化。对于通过生物化学方法分离的悬浮在缓冲液中的生物膜，如果改变缓冲液盐离子浓

度或 pH 值，都有可能有效地将PMP 从生物膜上解离下来。

图1　蓝藻类囊体膜结构示意图

Fig.1　Schematic　diagram　of　cyanobacterial　thylakoid　membrane

Ⅰ　类囊体膜是光合作用的主要场所，与此相关的一些主要的蛋白复合物如光合系统

(PhotosystemⅠ)　 Ⅱ　、光合系统 (PhotosystemⅡ)　、ATP 　合酶 (ATP　synthase)　以及与 CO2 固定相关的

NDH-13 和NDH-14 复合体均分布在类囊体膜上。这些膜蛋白质复合物既包含 IMP,　又包含

PMP。

疏水性是膜蛋白的一个重要生物化学特征。评价疏水性的关键指标有两个：第一个指标是分析

其是否含有跨膜结构域及其数目。所有的 IMP 都有一个或多个跨膜结构域，通常一个膜蛋白如

果所含的跨膜结构域数目越多，表明其疏水性越强，但有时也例外，因为膜蛋白整体疏水性还

会受到连接跨膜结构域的膜外区域大小的影响。一个蛋白是否含有跨膜结构域及其数目的多少

可以通过生物信息软件进行预测，常用的软件是基于隐马尔可夫模型的TMHMM，其预测 IMP

的准确度可以超过97%[7]。需要指出的是 TMHMM 目前有两个版本，即TMHMM1 和

TMHMM2。本课题组在具体的研究中发现，TMHMM2 在预测某些蛋白的跨膜结构域时反而不

如TMHMM1 准确。第二个指标就是蛋白质的 GRAVY 值。GRAVY 值是从总体上评价一个蛋

白质疏水性高低的参数。一般来说一个蛋白质的 GRAVY 值越高，表明其疏水性越强[8]。一个

蛋白质的 GRAVY 值取决于其氨基酸序列的构成。每个不同的氨基酸残基都有一个特定的疏水

　值(hydropathy　score)　　，疏水性最高的为异亮氨酸 (4.5)　　，其次为缬氨酸 (4.2)　，而亲水性最高的

　是精氨酸 (-4.5)　　，其次为赖氨酸 (-3.9)　。一般来说，侧链为长脂链的氨基酸其疏水性越高，而

侧链为极性的尤其是带电荷的氨基酸，其亲水性越强。GRAVY 值就是该蛋白质所有氨基酸疏

　水值的平均值，即所有氨基酸疏水值的加和除以该蛋白质的长度(所含氨基酸的数量)　。

1.2 　、膜及膜蛋白的分离纯化

尽管一个基因组所编码的蛋白有 30%被预测为膜蛋白，但总体上由于膜蛋白丰度较低，且不易

在水溶液中溶解，因此在进行膜蛋白质组学分析时，经常需要先对膜组分进行分离纯化，以富

集低丰度的膜蛋白。在一个全细胞裂解物中，由于膜组分的密度不同，在密度梯度离心中具有

不同于可溶性组分的沉降系数，借此可以与可溶性组分分离开。对于各种细胞器如线粒体、叶

绿体来说，一般都是先分离该细胞器，然后再分离其各个膜组分。以叶绿体为例，叶绿体含有

3个膜组分：组成叶绿体包被的外膜、内膜和类囊体膜。叶绿体的包被可以利用一种叫做 Yeda　

Press 的装置剥离下来，并通过密度梯度离心分离外膜和内膜[9,10,11,12,13,14,15]。被剥离包被

的叶绿体可以被直接裂解，并通过离心获得类囊体膜。

纯化的膜组分既含有 IMP,　又含有 PMP。由于 IMP 难溶于水溶液且一般丰度较低，因此难以被

现有的蛋白质组学技术鉴定。为提高 IPM 蛋白质组学鉴定的覆盖度，通常需要将水溶性较高的

PMP 与IPM 分离以便富集IPM 　。常见的分离方法有如下几种：(1)　高浓度盐溶液抽提法，即利

用高浓度的盐溶液（如1　mol/L　NaCl）来解离与膜结合的 PMP[16]。这种方法的原理是利用盐

离子所带的电荷，破坏介导 PMP 与膜相结合的静电相互作用，从而将 PMP 从膜上洗脱到溶液

中。经过1　mol/L　NaCl 抽提后的膜所含的 PMP 显着减少，而 IMP 　会因此得到显着的富集；(2)　

高pH 抽提法。细胞裂解后，膜组分由于磷脂双分子层的疏水性，在水溶液中通常是以囊泡的

形式存在。这些囊泡在形成过程中会把一部分可溶性蛋白包含进去，这样在分离纯化的膜组分

中就会造成可溶性蛋白的污染。用 100　mmol/L　Na2CO3 　溶液(pH11.0)　抽提纯化的膜组分，可

以将这些囊泡状的膜组分剪切开，形成片状，释放其中所包含的可溶性的污染蛋白[10]。同

时，由于高 pH 值可以改变蛋白质在水溶液中的电离效率，从而改变蛋白质所带的电荷，影响

蛋白质之间的静电相互作用，并因此将 PMP 从膜上解离下来，达到分离PMP 与IMP 　的效果；

(3)　　离液剂 (chaotropes)　　抽提法。常用的离液剂是高浓度(8　mol/L)　　的尿素(urea)　。尿素是一种强

极性的试剂，很容易与水及水溶液中的蛋白质形成氢键，从而破坏蛋白质之间的相互作用，把

PMP 　从膜上解离出来。除尿素外，硫脲 (thiourea)　是一种更强的离液剂，也经常在蛋白质组学

研究中用来溶解蛋白质[17,18] 　；(4)　　二相分离法(two　phase　partition)　。含有去垢剂 Triton　X-114

在0℃时会形成均一的水溶液，当温度升高到 20℃时，溶液就会分层，上层是水相，下层是去

垢剂相。这时溶解在 Triton　X-114 溶液中的膜蛋白也会随着分层，水相中主要包含可溶性蛋

白，如容易从膜上解离的PMP，而去垢剂相中主要包含和膜结合紧密的PMP 以及 IMP[19]。需

要注意的是，这些方法并不一定是单独使用，在实际研究中通常会把多种方法结合起来使用，

以达到提高分离效率的目的。

2 　、膜蛋白质组学相关技术

　　　 2.1 　、双向电泳与膜蛋白质组学

　双向电泳(2D　electrophoresis,　2DE)　是早期蛋白质组学研究最重要的技术之一，可以和 MALDI-

TOF　(matrix-assisted　laser　desorption/ionization　time　of　flight　mass　spectrometry)　　质谱技术结合

(2DE-MS)　，进行大规模快速的蛋白质鉴定[17,18]。双向电泳本质上是一种蛋白质分离技术，

可以把高复杂度的样品，如含有数万个蛋白的全细胞裂解物中的蛋白尽可能地分开[20]。一般

　来说，双向电泳的第一向为等电聚焦 (isoelectric　focusing,　IEF)　，即根据蛋白质的等电点进行分

离。蛋白质由氨基酸组成，在不同的酸碱环境下会发生不同程度的电离，因此蛋白质所处环境

的pH 值不同，其电离程度以及所带的净电荷也不同。在一个特定的 pH 值下，该蛋白质发生电

离使得其所带的净电荷为0，该pH 值即为该蛋白质的等电点。虽然所有的蛋白质都有一个特

定的等电点，但一旦该蛋白质发生翻译后修饰，其等电点则也有可能改变,　因此在 2DE 中很多

蛋白质会在电泳胶上形成分子量相等的多个点[17,18]。等电聚焦的本质就是让蛋白质在高电压

的作用下在一个 pH 梯度中进行迁移，当蛋白迁移到pH 梯度中与其等电点相等的位置时，由于

其所带的净电荷为0，不再受到电场力的作用，从而停留在该位置。一般商业化的 IEF 胶条都

是带有固定化的 pH 梯度，可以最大限度地提高实验结果的重复性。对于多种蛋白质来说，由

于其等电点有所不同，因此其停留的位置也有所不同。等电聚焦就是通过这个原理对蛋白质进

行分离的。需要指出的是，等电聚焦要想达到很好的分离分辨率，必须要排除环境中的带电离

子对蛋白质迁移的影响。因此，等电聚焦的缓冲液不能含有盐离子，最理想的迁移环境就是电

场中所有的电荷都来源于蛋白质自身。双向电泳的第二向是SDS-PAGE　(sodium　dodecyl　sulfate-

polyacrylamide　gel　electrophoresis)　。SDS-PAGE 主要是根据分子量的大小对蛋白质进行分离。

等电聚焦完成以后，可以把含有蛋白质的 IEF 胶条水平地转移到SDS-PAGE 凝胶顶端并用琼脂

糖凝胶固定住。在电场力作用下，蛋白质从 IEF 胶条中垂直进入到SDS-PAGE 胶中，进行第二

向分离。

2DE 的分辨率和 IEF 胶条以及 SDS-PAGE 的尺寸呈正相关。尺寸越大，分辨率越高，同时蛋白

　质样品的上样量也越大，可以更好地鉴定低丰度蛋白。虽然大尺寸的双向电泳(如24　cm　IEF 胶

条)　理论上可以将多达 1000 个以上的蛋白高分辨地呈现在一块凝胶上，但一般而言2DE 能分离

的蛋白通常都是亲水性的可溶性蛋白，而高疏水性的尤其是含有跨膜结构域的蛋白，绝大部分

都不能被双向电泳所分离。这是因为膜蛋白的溶解通常需要有去垢剂的辅助。去垢剂通常都有

一个非极性的基团和一个极性的基团，非极性的基团和蛋白质发生相互作用，而极性基团和溶

液中的水发生相互作用，从而帮助蛋白质溶解。不同的去垢剂辅助蛋白质溶解的能力是不同

的，目前已知的助溶能力最强的去垢剂是SDS，但 SDS 带有负电荷，蛋白质一旦结合大量的

SDS 后，SDS 本身的负电荷就会干扰等电聚焦，因此 SDS 与蛋白质的等电聚焦是不兼容的。

　通常与等电聚焦兼容的去垢剂都是非离子性的 (如Triton　X-100 和NP-40)　　，或者是双性的

(zwitterionic)　，即同时带一个正电荷和一个负电荷，总电荷为0，如常用的 CHAPS 和ASB14

都是双性去垢剂。遗憾的是，这些去垢剂的助溶能力远远低于SDS，因此绝大多数高疏水性的

膜蛋白都无法被双向电泳分离[21,22,23]。

　 2.2 　、基于 LC-MS 的膜蛋白质组学

基于美国科学家John　Yates – 　实验室在研发基于色谱质谱联用(liquid　chromatography-mass　

spectrometry,　LC-MS)　　的鸟枪法蛋白质组学 (shot-gun　proteomics)　技术上取得的卓越成就

文档加载中……请稍候！
如果长时间未打开，您也可以点击刷新试试。

下载文档到电脑，查找使用更方便

免费 4人已下载

立即下载

摘要：

近20余年膜蛋白质组的研究成果综述　摘　　　　要：　生物膜是一类重要的亚细胞结构，含有大量的跨膜蛋白和非跨膜蛋白，负责细胞与外界的物质和信息交换以及行使细胞内的多种功能。鉴定并分析膜蛋白在生物膜上的表达是研究其功能必不可少的步骤。蛋白质组学技术可以在单次实验中一次性从全细胞裂解物中鉴定多达上万个蛋白质，从而为分析这些蛋白的表达提供了直接的证据。但由于膜蛋白具有较强的疏水性，从而导致对膜蛋白的蛋白质组学鉴定相对困难，这也使得对膜蛋白的结构与功能的研　究进展相对比较缓慢。随着鸟枪法蛋白质组学(shot-gun　proteomics)　　及滤膜辅助的样品制备(filter　aided　sample　...

展开>> 收起<<

近20余年膜蛋白质组的研究成果综述.docx

共9页,预览3页

还剩页未读，继续阅读

近20余年膜蛋白质组的研究成果综述

相关推荐

开通VIP享超值会员特权

作者详情

相关内容

推荐作者

热门标签

举报选择: