HSP70 CD80DNA疫苗治疗小鼠急性哮喘的作用
HSP70/CD80DNA 疫苗治疗小鼠急性哮喘的作
用
哮喘是一种免疫调节异常的呼吸系统疾病,其发病机制复杂.免疫反应异常是哮喘发生的重要环
节,在哮喘中发挥关键作用[1]. 本课题前期构建了热休克蛋白 70 ( heat shock protein70,HSP70)
/CD80 DNA 疫苗,以该重组融合蛋白作为免疫原,刺激机体产生免疫应答. 并观察
HSP70/CD80DNA 疫苗对小鼠急慢性哮喘的预防和治疗作用,发现其机制可能是从非特异性免疫
方面恢复辅助性 T 细胞 1 ( T helper cell 1,Th1) / 辅助性 T 细胞 2(T helper cell 2,Th2)平衡[2-3].随
着人们对 CD4 +T 细胞认识的逐渐深入, 发现 CD4 + CD25 + 调节性 T 细胞( regulatory T
cell,Treg) 和辅助性 T 细胞 17(T helper cell 17,Th17)也在哮喘的发生中具有重要作
用.HSP70/CD80 DNA 疫苗在治疗哮喘的过程中是否也调节 Treg /Th17 的平衡,目前尚不清楚.
本研究拟探讨 HSP70/CD80 DNA 疫苗治疗小鼠急性哮喘的作用及其对 Th1/Th2/Treg /Th17 的影
响,旨在为该疫苗的临床应用提供实验基础.
1 材料与方法
1. 1 材料 健康雌性、SPF 级近交系 BALB / c 小鼠购于第三军医大学; HSP70/CD80 DNA 质粒由
泸州医学院附属医院感染与免疫实验室构建[4];End-ofree 质粒大量提取试剂盒购于德国 QIAGE
公司; 离心柱式总 RNA 提取试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司;iScriptTMcDNA Synthesis
Kit 购自美国 Bio-Rad 公司;TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTMII 购自宝生物工程( 大连) 有限公
司;Real-time PCR 引物由宝生物工程(大连)有限公司合成.
1. 2 方法 1. 2. 1 疫苗制备 pVAX1 ( +) 质粒和 HSP70 /CD80 DNA 质粒的制备按照试剂盒说明书
进行.测定纯度及浓度后,用生理盐水调整浓度到 1 mg/mL 备用,-20 ℃存储.
1. 2. 2 动物模型制备 BALB / c 小鼠随机分为 4组:空白对照组(空白组),哮喘模型组(模型
组),pVAX1(+) 空载体对照组( 空载组) 和HSP70 / CD80 疫苗治疗组(治疗组), 每组 10 只.模型制
备过程中, 空载组死亡 1 只小鼠. 实验开始第 0 和14 天, 新鲜配制含 10 μg 鸡卵清蛋白
(ovalbumin,OVA) 的铝佐剂混悬物 200 μL,分别腹腔注射模型组、空载组和治疗组小鼠,而空白组
小鼠注射等剂量生理盐水. 第17 和25 天, 治疗组小鼠股四头肌处肌内注射 100 μg HSP70/CD80
DNA 疫苗,空载组注射 100 μg pVAX1,空白组和模型组注射等体积生理盐水. 第28 天,对模型
组、空载组和治疗组小鼠以 1% OVA 行雾化吸入激发, 连续 7 次,30 min / 次.空白组生理盐水雾
化.
1. 2. 3 气道反应性检测 最后一次 OVA 雾化 24 h 内,吸入乙酰甲胆碱(methacholine,Mch)后检测小
鼠肺功能, 全身体积描记仪记录 Penh,按以下公式计算出% 基线Penh 值:100 × ( 检测 Penh 值- 基
线Penh 值) / 基线Penh 值,各组进行比较.
1. 2. 4 ELISA 法检测血清IgE 取小鼠眼球血,4 000 r / min 离心 10 min,收集血清,- 80 ℃ 保存.
1. 2. 5 观察肺组织病理学改变 切取肺组织固定于 4%多聚甲醛 12 h.制备切片, 进行 HE 和AB-
PAS 染色.镜下观察炎细胞浸润、杯状细胞增生分泌情况,参照文献对炎细胞浸润和杯状细胞进
行评分[5-6].
1. 2. 6 ELISA 法检测气管肺泡灌洗液( bronchoal-veolar lavage fluid,BALF) 中细胞因子含量 注入
400 μL 生理盐水到主支气管, 反复灌洗 3 次,吸出BALF,2 000 r / min 离心 10 min,收集上清, 检测
γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、白细胞介素-4(inter-leukin-4,IL 4) 、转化 生 长因子β
( ransforminggrow th factor beta,TGF-β)和白细胞介素-17(inter-leukin-17,IL 17)含量.
1. 2. 7 检测肺组织中转录因子 mRNA 水平 按试剂盒说明书进行肺组织总RNA 提取、逆转录和
Real-time PCR 反应. 检测各样本T-bet、GATA 连接蛋白 3(GATA binding protein 3,GATA3)、叉
头蛋白 3(forkheah box protein3,Foxp3) 和维甲酸受体相关孤儿受体( retinoid related orphan
receptorgamma t,RORγt) Ct 值. 根据Ct 值, 用软件 ABIStepOne 进行分析, 按公式 2- CT△△ 计算各
样本相对表达量.
1. 3 统计学处理 采用SPSS 17. 0 软件.先用Shapiro-Wilk 行正态分布检验,符合正态分布即可用
方差分析行多组间比较, 用LSD 检验行多组间两两比较,数据以x± s 表示. 如不符合用 Kruskal-
Wallis H 检验行多组间比较, 用Mann-Whitney U 检验行多组间两两比较, 数据以M(P25,P75) 表
示.P < 0. 05 为差异有统计学意义.
2 结 果
2. 1 气道反应性的改变 见表 1.Mch 吸入浓度达到24 mg /mL 后,与空白组小鼠相比,模型组和空
载组小鼠气道反应性升高 (P <0. 05);与模型组小鼠相比,治疗组小鼠气道反应性降低(P <0. 05).
2. 2 IgE 水平的变化 模型组和空载组的血清IgE 浓度[(7.45 ±0.81) pg/mL,(7. 08 ±0. 74) pg/mL]高
于空白组[(5. 36 ±0. 29) pg /mL],P <0. 05; 治疗组的血清IgE 浓度[(5. 91 ±0. 52) pg /mL]低于模型
组和空载组(P <0. 05).
2. 3 肺组织炎细胞浸润和黏液分泌情况 见表 2 、图1.与空白组相比,模型组和空载组小鼠肺组织
出现大量炎细胞浸润(P <0. 05),以单核细胞和嗜酸粒细胞为主;与模型组和空载组相比,治疗组小
鼠的气道、血管周围和肺泡区炎症反应减轻 (P <0. 05) .AB-PAS 染色后进行杯状细胞评分,结果
表明,模型组和空载组小鼠的支气管上皮中阳性杯状细胞增多(P <0. 05);与模型组相比,空白组和
治疗组小鼠杯状细胞增生不明显(P <0. 05).
摘要：
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HSP70/CD80DNA疫苗治疗小鼠急性哮喘的作用哮喘是一种免疫调节异常的呼吸系统疾病,其发病机制复杂.免疫反应异常是哮喘发生的重要环节,在哮喘中发挥关键作用[1].本课题前期构建了热休克蛋白70(heatshockprotein70,HSP70)/CD80DNA疫苗,以该重组融合蛋白作为免疫原,刺激机体产生免疫应答.并观察HSP70/CD80DNA疫苗对小鼠急慢性哮喘的预防和治疗作用,发现其机制可能是从非特异性免疫方面恢复辅助性T细胞1(Thelpercell1,Th1)/辅助性T细胞2(Thelpercell2,Th2)平衡[2-3].随着人们对CD4+T细胞认识的逐渐深入,发现CD4+...
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作者：闻远设计
分类：其它行业资料
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时间：2024-04-02
