陈皮经黑曲霉发酵后的体外抗氧化活性分析

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陈皮经黑曲霉发酵后的体外抗氧化活性分析

　摘要：目的：考察黑曲霉发酵对陈皮黄酮类成分及抗氧化活性的影响。方法：采用超高效液

相色谱法(UPLC)及紫外分光光度法(UV)对发酵前后黄酮类成分含量进行测定，采用清除 1,1-二

苯基-2-苦肼基(DPPH)自由基、2,2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基进行抗氧化

活性评价。结果：发酵陈皮黄酮类成分含量及抗氧化能力较未发酵陈皮均有提高，且随着发酵

时间延长，总黄酮、橘皮素含量及清除 DPPH 自由基能力呈现先增后减趋势，橙皮苷、川陈皮

素含量及清除 ABTS 自由基能力则一直呈现上升趋势。结论：黑曲霉发酵可提高陈皮黄酮类成

分含量及抗氧化活性，发酵时间对其影响显著。

　关键词：陈皮; 黑曲霉; 黄酮类; 抗氧化活性;

Effects of Aspergillus niger fermentation on flavonoids and antioxidant activity of pericarpium citri

reticulatae(PCR)

YANG Dan YANG Fangqing YAN Nana CHEN Hongping LIU Youping

Department of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Standardization

Education Ministry Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine, Breeding Base of State Key

Laboratory of Resources System Research and Development Utilization of Chinese Herbal Medicines

Co-constructioned by The Ministry of Science and Technology of the PRC and Sichuan Province

　　 Abstract：Objective: To study the effect of Aspergillus niger fermentation on flavonoids and

antioxidant activity of PCR. Methods: The content of flavonoids before and after fermentation was

determined by UPLC and UV, and the antioxidant activity was evaluated by scavenging free radicals

of 1,1-diphenyl-2-hydrazidyl(DPPH), 2,2'-diazo-di3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid(ABTS).

Results: The content of flavonoids and antioxidant capacity of fermented PCR were increased

compared with those of unfermented. With the prolonged fermentation time, the content of total

flavonoids, tangeratin and the ability to scavenge DPPH free radicals increased first and then

decreased, while the content of hesperidin and nobiletin and the ability to scavenge ABTS free radicals

increased all the time. Conclusion: Aspergillus niger fermentation can improve the content of

flavonoids and antioxidant activity of PCR, and the fermentation time has a significant effect on it.

陈皮为芸香科植物橘 Citrus reticulata Blanco 及其栽培变种的干燥成熟果皮，具有理气健脾、燥

湿化痰之功效[1]。黄酮类成分作为陈皮主要活性成分之一，主要包含黄酮、黄酮醇、黄烷酮

(橙皮苷、新橙皮苷)、多甲氧基黄酮(川陈皮素、橘皮素、3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黄酮)等。现

代药理研究表明，其不仅对消化系统及心血管系统疾病有较好的治疗作用，还具有抗氧化、抗

肿瘤、抗炎、抑菌等多种生物活性[2]。已有文献考察陈皮黄酮类成分的抗氧化活性[3,4,5,6]，

结果均表明其具有较好的抗氧化能力。

黑曲霉因其强大的酶系及安全性，在发酵工业生产中广泛应用，已有研究报道银杏叶[7]、黄芪

[8]、瞿麦[9]等经黑曲霉发酵后其黄酮含量和抗氧化能力均有提高。目前有研究表明陈皮经细

菌发酵后其抗氧化活性有所提高[10]，课题组前期研究也表明黑曲霉发酵后的陈皮对氧化性肝

损伤小鼠的保护作用增强[11]，但尚未对黑曲霉发酵后陈皮的体外抗氧化活性进行考察。因此

采用黑曲霉对陈皮进行发酵培养，通过测定发酵前后黄酮类成分含量，比较发酵前后的抗氧化

活性，包括对 DPPH 自由基及 ABTS 自由基的清除作用，以期为陈皮的下一步开发利用提供理

论依据。

　　 1　材料与方法

1.1 材料与仪器

陈皮样品为课题组前期在四川省成都市金堂镇收集，经成都中医药大学药学院中药鉴定教研室

严铸云教授鉴定，为芸香科植物大红袍 C.reticu1ata“Dahongpao” 的干燥成熟果皮。

黑曲霉：课题组前期从陈皮中分离纯化而来，低温保存；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基

(DPPH)、2,2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、Trolox(水溶性VE)、甲醇(分析纯)、

过硫酸钾：国产试剂；橙皮苷对照品(纯度98.76%，批号：MUST-18032502)、川陈皮素对照品

(纯度99.46%，批号：MUST-14100814)、橘皮素对照品(纯度99.77%，批号：MUST-

17050902) ：成都曼思特生物科技有限公司。

Multlskan Mk3 酶标仪：赛默飞世尔仪器有限公司；智能人工气候箱：浙江托普云农科技股份

有限公司；BP211D 电子分析天平：德国 Sartorius 股份有限公司；Agilent 1290 超高效液相色谱

仪：美国 Agilent 科技有限公司；UV-1100 型紫外- 可见分光光度计：上海天美科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黑曲霉发酵陈皮

称取 8 g 陈皮样品粉末样品平铺于培养皿中，紫外线照射灭菌30 min，翻面，继续照射 30

min。将灭菌好的样品分为对照组和发酵组。发酵组：每培养皿精密加入 1 mL 标准黑曲霉孢子

悬浮液；对照组：精密加入 1 mL 无菌水。编号标记，每个样品 3个平行。将2组样品置于人

工气候箱中30℃、95%RH 恒温恒湿培养，分别于发酵第5、7、9、11、13 天进行取样。

1.2.2 陈皮黄酮类成分含量测定

供试品溶液制备参考文献[12]：精密称取陈皮样品粉末约 0.2 g，加入甲醇 25 m L，称重，在

75℃下水浴回流 1 h ，冷却，用甲醇补重，过滤，即得供试品溶液。

1.2.2. 1 总黄酮含量测定

总黄酮测定方法参考文献[12]：以橙皮苷为对照品溶液做标准曲线，以橙皮苷浓度为横坐标

(X)、吸光度值为纵坐标(Y)，做线性回归，得回归方程为Y=29.636X+0.0079,R2=0.9999。精密

量取供试品溶液0.2 mL，定容至 10 mL 容量瓶中，置于紫外分光光度计中，在 283 nm 波长下

进行测定。根据标准曲线计算总黄酮含量。

1.2.2. 2 3 种黄酮类成分含量测定

3种黄酮类成分测定方法根据课题组前期建立方法[13]，略做调整：色谱柱为Boston PHlex

ODS(4.6 mm×250mm,5μm)；流动相采用 0.1%磷酸水-乙腈(B)，按以下梯度程序洗脱：0～10

min,20～30%B;10～20 min,30～50%B;20～25 min,50～52%B;25～30 min,52%B;30～35 min,52～

95%B;35～37 min,95%B，后运行5 min；柱温 30℃；流速 0.7 mL/min；检测波长283 nm 及

335nm；进样量：5.0μL。取供试品溶液过 0.22μm 微孔滤膜，按选定的色谱条件测定陈皮样品

中3 种黄酮类成分的含量。

1.2.3 抗氧化活性测定

1.2.3. 1 DPPH 自由基清除能力测定

参考文献[14]，略做调整。D P P H 自由基储备液：称取 0.0631 g DPPH，用适量甲醇溶解，定

容至 10 mL 容量瓶中，摇匀，作为储备液(16 mmol/L)低温避光保存备用。取l mL DPPH 储备

液用甲醇定容至 100 mL，得到 160μmo1/L DPPH 溶液。

取1.2.2 项下供试品溶液(浓度为 8.0 mg/mL)依次稀释至 0.8、3.2、4.8、6.4、8.0 mg/mL。样品

组(A1)：以不同浓度提取液为样品溶液，吸取 20μL，加样于96 孔板中，再加入 180μL DPPH

溶液；对照组(A2)：吸取样品溶液20μL，加样于96 孔板中，再加入 180μL 甲醇溶液；空白组

(A0)：吸取 20μL 甲醇，加样于96 孔板中，再加入 180μL DPPH 溶液。充分混匀后，室温避光

反应30 min，置于酶标仪中，于517 nm 波长处测定，记录吸光度值。每个样品设3个复孔，

取平均值。根据系列浓度下的清除率，计算出达到半数清除率浓度(IC50)。其 IC50 值越小，其

抗氧化能力越强。

提取物清除 DPPH 自由基的能力按下式计算：

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摘要：

陈皮经黑曲霉发酵后的体外抗氧化活性分析　摘要：目的：考察黑曲霉发酵对陈皮黄酮类成分及抗氧化活性的影响。方法：采用超高效液相色谱法(UPLC)及紫外分光光度法(UV)对发酵前后黄酮类成分含量进行测定，采用清除1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)自由基、2,2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基进行抗氧化活性评价。结果：发酵陈皮黄酮类成分含量及抗氧化能力较未发酵陈皮均有提高，且随着发酵时间延长，总黄酮、橘皮素含量及清除DPPH自由基能力呈现先增后减趋势，橙皮苷、川陈皮素含量及清除ABTS自由基能力则一直呈现上升趋势。结论：黑曲霉发酵可提高陈皮黄酮类成分含量及抗氧化活性，发...

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