单克隆抗体药物不稳定性因素和改善措施

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单克隆抗体药物不稳定性因素和改善措施

　　摘　　　　要：　单克隆抗体药物是生物药物的重要分支，因其靶向性、特异性高而受到广泛关

注。随着单克隆抗体技术的不断发展，抗体药物在疾病预防、诊断和治疗方面发挥着举足轻重

的作用。但是，抗体药物作为一种人工合成蛋白质的天然属性，其在生产、储存及体内使用过

程中，容易受到体内外复杂环境的物理和化学方面的影响，发生多种形式的理化性质改变，进

而导致其免疫原性增加，半衰期缩短，甚至失效。因此如何提升抗体药物的稳定性，降低免疫

原性，延长半衰期，提高其体内生物利用度是目前抗体药物应用中亟待解决的关键问题。本文

从影响抗体稳定性的因素（结构、环境及制备工艺）、理化机制以及提高抗体稳定性的方法等

几个方面，对近期文献报道的相关研究进行简要的综述。

　　　关键词 :　　　　　单克隆抗体;理化因素;稳定性提高;生物制药;

　　 Abstract：　 Monoclonal　antibody(mAb)drugs　have　attracted　widespread　attention　for　their　high

targeting　and　specificity　as　an　important　branch　of　biopharmaceutics.　With　the　rapid　development　of　

mAb　drugs,they　play　an　irreplaceable　role　in　disease　prevention,diagnosis　and　treatment.　While　as　a　

kind　of　large　synthetic　molecule,due　to　its　natural　attribute,the　mAb　is　easy　to　be　affected　in　stability　

by　the　physicochemical　factors　in　vitro　and　vivo　during　manufacturing,storage　and　application.　

Various　forms　of　physical　and　chemical　properties　change　of　mAb　will　lead　to　increased　

immunogenicity,shortened　half-life,and　even　failure.　Therefore,how　to　improve　the　stability,reduce　

immunogenicity,extend　half-life,and　then　increase　bioavailability　is　a　key　issue　that　needs　to　be　

urgently　solved　in　the　application　of　antibody　drugs.　This　article　review　the　latest　research　about　the　

factors　including　protein　structure,environmental　stress,manufacturing　technique　that　affect　the　

antibody　stability.　Besides,the　mechanism　and　the　methods　of　optimization　are　also　referred.

　　 Keyword：　 Monoclonal　antibody;　Physicochemical　factors;　Stability　improvement;　

Biopharmaceutical;

　　在过去的 30 年里，单克隆抗体（monoclonal　anti?body,mAb）的研发和优化技术已经取得

了长足的发展，现阶段治疗性单克隆抗体药物已经广泛应用于自身免疫病、肿瘤以及病毒感染

等疾病的临床治疗或预防，且已成为生物制品类药物中发展最快的一类。学者们在长期研究中

除了重点关注抗体结构的优化，还针对抗体稳定性的各种影响因素提供了诸多解决方案，以此

降低抗体药物的开发、储存成本，并提高其临床疗效[1,2,3]。本文简要回顾了近些年单克隆抗

体稳定性的影响因素和理化机制以及抗体稳定性改造方案等方面的研究进展。

　　 1　、抗体分子结构及稳定性研究意义

　　 1.1 　、抗体分子结构

　　抗体是指由机体产生能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。抗体由 B淋巴细胞转化而来的浆

细胞分泌产生，每个 B淋巴细胞株只能产生一种它专有的、针对一种特异性抗原决定簇的抗

体。这种从一株单一细胞系产生的抗体就叫单克隆抗体（mAb），简称单抗。常规的单抗分子

是由两条重链（HC）及两条轻链（LC “）通过链间二硫键连接成 Y”形结构（图 1），它又可分

为3个功能组分：两个抗原结合片段（Fab）和一个结晶区（Fc），两个 Fab 通过铰链区连接

到Fc，且构象变化相比于Fc 更为灵活。由来自重链和轻链的一对可变区（VH 和VL）组成

Fab 的Fv 区，通常 Fv 区被糖基化修饰，是决定抗体如何与适应性免疫及体液免疫系统中的其

他成分相互作用的关键。

　　 1.2　、稳定性研究意义

　　研究发现，某些单克隆抗体药物虽然在体外实验中表现出良好的药物活性，但在进入临床

试验阶段却会遭遇到体内活性降低的问题[4]。因此在药物研发的初期就要兼顾其药效动力学的

问题。抗体药物的稳定性是影响抗体药效动力学的关键因素之一，首先抗体的高亲和力与高特

异性都需要以稳定的结构为基础，这是其正确行使生物学功能的保障。其次，抗体的稳定性越

高，则其新生肽链在细胞内装配时产生错误折叠（mis-folding）的概率越低，可溶性表达量也

越高[5]。良好的热稳定性所带来的紧凑结构使抗体的蛋白酶切位点更不易暴露，并其影响药品

保质期及存放条件，关系到药物成本。目前，提高蛋白质热稳定性的方法主要有非共价修饰、

化学修饰、添加蛋白质稳定剂、蛋白质工程，以及在液体状态利用矿化技术直接在蛋白表面形

成磷酸钙矿化外壳以提高蛋白质的稳定性[6]。

　　由此可见，在保证抗体亲和力及表达量等性质不受太大影响的情况下，最大程度上提高其

稳定性，对抗体药物的研发具有重要的现实意义。

　　图1　完整 IgG 抗体带状图[来源：蛋白结构数据库（PDB);ID:1igt]

　　 Fig.1　Complete　structure　of　IgG[From:Protein　Data　Bank(PDB);ID:1igt]

　　 2　、影响抗体稳定性的因素

　　 2.1 　、抗体分子自身性质

　　抗体分子一级结构（蛋白序列）对其聚集性有着重要影响，例如当抗体分子的等电点

（pI）过高或过低时决定簇互补区（com?plementarity-determining　region,CDR）都会促进聚

集，不同的是较低pI 的分子所产生的分子间静电相互作用形成了可溶的聚集物，而较高pI 的

分子，尤其是当和带有负电荷的容器表面接触时，则会形成沉淀性聚集[7]。例如有研究比较了

英夫利昔单抗（infliximab）及其仿制药在强制性降解试验（forced　degradation）中的表现[8]，

发现二者尽管在生产工艺和制造过程上有些许不同，但在该试验中并未表现出明显差异，说明

一级结构仍然在很大程度上决定了抗体分子的稳定性。还有研究比较了IgG 分子的 3个亚型

（IgG1、IgG2、IgG4）在分别经过酸性处理（pH=3.3）之后的表现，结果IgG1 保持了单体形

式，而另外两个亚型均表现出二聚化倾向，且当恢复到正常pH 时导致 IgG4 形成聚集体[9]。该

结果与pH 在4～7范围内IgG 亚型聚集性（IgG1<IgG2<IgG4）的强弱对比相印证[10]。KERR

等[11]通过高分辨率质谱分析了治疗性抗体高级结构（HOS）对曲妥珠单抗、贝伐珠单抗及利

妥昔单抗药物储存的影响，发现贝伐珠单抗可变区和恒定区在特定温度下存在肽键水解。

　　 2.2 　、环境应力因素

　　温度：高温能够破坏单抗结构，且通常不可逆，进而导致聚集；同时伴随温度增高，脱酰

胺和氧化反应发生的概率也增加[12]。当环境温度下有50%左右的蛋白天然结构展开时，将该

温度定义为熔解温度（melting　temperature,Tm），每种蛋白都有其 Tm，一般该温度范围为

40℃～80℃之间，而通常生物药品储存运输的温度在 2℃～8℃之间，远低于该温度[13]。此外

过低温也会引起蛋白变性，尤其是在反复冻融的情况下。随着冻融次数增加，会出现缓冲液

pH 值下降、溶质分子浓缩、水冰界面形成等因素的影响[14]。当0.5　mg/ml 贝伐珠单抗

（bevacizumab）溶液经受 1～30 次冻融循环时，其单体峰通过（size　exclusion　

chromatography,SEC）分析，发现随着循环次数的增加而降低。在类似的研究中，对于固定数

量的循环冻融（10 个循环），单体峰值随着贝伐珠单抗浓度的增加而降低，这表明在较高浓度

下冻融循环的稳定性有所提高[15]。

　　光照：蛋白质的芳香族残基（以色氨酸残基为主）对光照非常敏感，易发生光氧化形成氧

化自由基，随后发生断裂和交联，尤其是紫外光相较于白光影响更大[16]。有研究证实光照对

蛋白质二级和三级结构的影响取决于其存在形式，通常冻干粉比液体制剂更能耐受光照。LUIS

等[17]通过采用ICH　Q1B(International　Council　for　Harmonisation,ICH　Q1B　conditions）推荐值

（132 万勒克斯小时）和环境光照强度（24 万勒克斯小时）评估了两种单克隆抗体的光稳定

性，结果显示出巨大的差异，表明单抗药物的光稳定性取决于总的曝光量而不是光强

度。SHAH 等[18]发现了在 ICH 光照条件下虽然总体上未观察到明显的抗体结构变化，但 CH2

结构域仍然存在降解。蛋白质药物主要的光暴露发生在储存运输和给静脉输液患者用药期间，

因此在药品应用阶段规避这一因素的影响就显得尤为重要。

　　机械应力：在单抗药物生产使用过程中还会受到机械应力（如搅拌或剪切力）的影响。研

究证实由于疏水性基团（主要是巯基）暴露，在该过程中形成了大量规格在1.5～80μm 不等的

聚集体，且聚集水平与气-液界面积呈指数关系[19]。药物制剂在通过输液管或注射器时会产生

剪切力作用，已有研究报道了高浓度单抗溶液的剪切稀化现象（剪切力下黏度的降低），这可

能与自身聚集的单抗分子解离有关，但目前尚不清楚过滤过程中的剪切力是否会引起其他改变

[20]。

　　 2.3 　、存储方式因素

　　浓度：高浓度下的单抗制剂由于黏度增加，分子间相互作用增强也会促进聚集

[21]。HAUPTMANN 等[22]发现高浓度仅仅会增加制剂中小颗粒的数量，而分子量大的聚集物

反而减少了；NICOUD 等[23]则观察到聚集物随浓度增加而增加的现象。有研究指出，虽然降

低抗体浓度可以使结合性较弱的聚集体解离，但若不同时改变抗体分子与辅料的比例，则会稀

释药物制剂中的辅料（具有保护性的糖类、表面活性剂或精氨酸），影响了溶液本身的 pH 值

和离子强度，导致抗体分子化学稳定性降低[24]。此外，蛋白质分子自身具备聚合倾向，是由

分子间的电荷相互作用所主导，且受溶液的离子强度影响[25]。

　　包装：除对单抗药物固有属性及结构的优化外，也不能忽略在现有生产条件下包装存储方

式的影响。蛋白质作为表面活性分子，有吸附到疏水界面的倾向从而导致产品损失、效力降低

和潜在的剂量不足[26]。KUMRU 等[27]的研究结果表明聚氯乙烯（PVC Ⅳ）材质的输液袋（-

bags）相较于聚烯烃材质对 1　mg/ml 的IgG4 溶液吸附效果更明显，且颗粒物和浑浊度明显增

加，而在加入聚山梨酯 20 后两种输液袋中的颗粒数降低至接近阴性对照。

　　 3 　、影响抗体不稳定性的机制

　　造成抗体不稳定性的因素大致划分为化学不稳定性因素和物理不稳定性因素。它们各自对

抗体性质产生影响，且彼此相互作用：相关化学反应可导致物理不稳定性[13]，物理不稳定性

又可使某些活跃的化学基团产生变化，或将有可能相互作用的基团间距离拉近[28]。

　　 3.1 　、化学不稳定性的作用机制

　　氧化作用：化学降解不仅不利于抗体药物的储存，在应用中还会使药物有效性发生损耗。

氧化反应（包括二硫键的形成）是最常见的引起化学降解的因素，这种氧化可以发生于氧化剂

（例如：光照、过氧化物或者活泼金属）存在的情况下，也可以自发氧化的形式产生[29]。抗

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摘要：

单克隆抗体药物不稳定性因素和改善措施　　摘　　　　要：　单克隆抗体药物是生物药物的重要分支，因其靶向性、特异性高而受到广泛关注。随着单克隆抗体技术的不断发展，抗体药物在疾病预防、诊断和治疗方面发挥着举足轻重的作用。但是，抗体药物作为一种人工合成蛋白质的天然属性，其在生产、储存及体内使用过程中，容易受到体内外复杂环境的物理和化学方面的影响，发生多种形式的理化性质改变，进而导致其免疫原性增加，半衰期缩短，甚至失效。因此如何提升抗体药物的稳定性，降低免疫原性，延长半衰期，提高其体内生物利用度是目前抗体药物应用中亟待解决的关键问题。本文从影响抗体稳定性的因素（结构、环境及制备工艺）、理化机制以及提高抗...

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