目前单克隆抗体药物研发的一般流程

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目前单克隆抗体药物研发的一般流程

国家十二五规划中明确提出: 增强新药创制能力,加快单克隆抗体药物的研究,重点开发治疗恶性

肿瘤的抗体药物,突破生物技术药物产业化的技术瓶颈,开发自主知识产权产品,抢占世界生物技

术制药的制高点.笔者主要总结了目前单克隆抗体药物研发的一般流程,为发现、降低研发技术

风险提供参考.

1背景与现状

随着当前工业化、城市化、老龄化进程的不断推进,生态环境的恶化和生活压力的不断加大,恶

性肿瘤的发病率越来越高.近20 年来我国癌症有年轻化趋势,发病率和死亡率"三线"不断走高,每

年新发肿瘤病例约为 312 万例, 平均发病率为 285. 91 /10 万, 平均每分钟有 6 人被诊断为恶性肿

瘤.

恶性肿瘤的严重性导致肿瘤治疗的需求不断增加,抗肿瘤药物的种类不断增加,药物市场迅猛发

展.2007 年以来,抗肿瘤药物一直是全球医药市场的领头羊,目前全球流行的抗肿瘤药物主要是生

物药物、靶向小分子药、激素等.单克隆抗体(McAb,简称单抗) 技术又被称为肿瘤"生物导弹",是

能直接导向肿瘤的药物[ 1 - 2 ].单抗抗肿瘤药物以其良好的临床效果和极佳的生物靶向性,稳居

抗肿瘤药物的前 3 位[ 3 ].2007 年至 2011 年全球抗肿瘤药物销售总额前 5 名中, 利妥昔单抗 291.

65 亿美元,贝伐单抗 261. 3 亿美元, 曲妥珠单抗 247. 33 亿美元, 伊马替尼 195. 88 亿美元,亮丙瑞林

116. 89 亿美元.可见,2007 年到 2011 年抗肿瘤药物的销售额巨大, 排名前 3 位的都是以单抗技术

制备的抗肿瘤药物.2012 年, 利妥昔单抗、曲妥珠单抗、贝伐单抗的销售额分别达到了 56. 22

亿、58. 89 亿和 57. 64 亿瑞士法郎, 占其制药公司药品收入比重的 16% ,17% 和16%[ 4 ].

单抗肿瘤药物的市场需求巨大,形成鲜明对比的是,我国单抗抗肿瘤药物研发能力的薄弱.单抗抗

肿瘤药物的研发壁垒高,我国单克隆药物技术和国外先进水平有很大差距.单抗抗肿瘤药物的巨

大市场需求和国内现阶段的技术发展水平,促使我们必须降低新药的研发风险,增强单抗抗肿瘤

药物的研发能力.

2研发的一般流程及风险分析

2.1 肿瘤靶点的发现和选择

新药的研发过程时间较长.据美国食品药物管理局(FDA) 统计,一种新药从研发到最后投入市场

平均需要 12 年, 其中实验室研究阶段需占用约5 年时间[ 5 ].药物靶标是新药研发的基础,单抗抗

肿瘤药物研发正是要找到相关肿瘤靶点,才能研制出针对肿瘤疾病的抗体药物.单克隆抗体药物

出现的 30 多年来,针对抗肿瘤药物的靶点,已经研制出多种单抗药物.目前已发现的肿瘤靶点和肿

瘤药物如表 1 所示[ 6 - 8 ].对未知靶点研究的缺乏制约着单抗抗肿瘤新药的研发,随着以基因工

程和分子生物学为代表的生物技术的发展,使针对靶点的高通量筛选成为可能,肿瘤靶点的研究

不断深入,靶点集中于细胞死亡通路、血管生成、细胞周期调控信号转导等方面[ 9 ].目前国内单

抗抗肿瘤药物靶点的发现主要基于 3 个纵向层次的研究,即基因水平、转录水平和蛋白水平的靶

点发现[ 10 ].

基因水平的单抗药物靶标发现: 从基因库中搜寻,人类基因组的不断发展,扩大了新基因的筛选范

围,根据建立的基因数据库,通过计算机模拟,就会增加药物靶标发现的概率; 基因芯片技术,利用

核酸杂交和碱基互补配对,用大量生物分子检测样品的遗传信息,筛选药物靶标[ 11 ]; 基因敲除技

术, 是指对1 个结构已知而功能未知的基因,从分子水平上设计试验,将该基因去除或用其序列相

近的基因取代,然后从整体观察实验动物,推测相应基因的功能,发现药物的相关靶点.

转录水平的单抗药物靶标发现: 主要分为反义寡核苷酸技术和 RNA 干扰技术,对于单抗抗肿瘤

药物运用最广泛的是 RNA 干扰技术.该技术能特异、高效地抑制基因表达,引起功能表型丢失,

可以确定相应蛋白质功能,快速有效地鉴别药物新靶点.

蛋白水平的单抗药物靶标发现: 噬菌体展示技术,利用肿瘤外源蛋白或多肽与待筛选药物的特异

性亲和作用,将特异性结合的外源蛋白或多肽的噬菌体大量富集,然后通过测序分析噬菌体表面

展示的蛋白结构,发现可与药物特异性结合的靶点; 蛋白芯片技术, 是以蛋白质代替DNA 作为检

测对象,测基因的表达和蛋白分子间的相互作用,以及协助寻找疾病诊断和治疗的靶分子;三杂交

系统,利用蛋白质间的相互作用,可检测出与特定小分子作用的蛋白,从而发现肿瘤靶点.

目前靶点发现存在的困难可总结为以下几个方面: 基因水平筛选的风险主要来自于基因技术发

展还不成熟,对所有基因的作用不明了导致获得靶点的效果不理想[ 10 ]; 转录水平筛选的风险主

要来自 RNA 干扰技术,该技术在肿瘤细胞中转染效率较低,动物体内和人体内结果的相似性有待

考察,在特异性设计上还有较大难度[ 12 ]; 蛋白水平筛选风险来自噬菌体展示的容量大小,特异性

检测水平的程度以及筛选后蛋白功能具体测定的精确度[ 13 ].

2.2 单抗抗肿瘤药抗原制备

靶点明确之后,就可以进入抗原的制备阶段.根据特异性的不同,肿瘤抗原可以分为肿瘤特异性抗

原和肿瘤相关抗原; 根据抗原种类的不同,可分为天然蛋白质抗原、基因重组抗原、合成性抗原

和小分子半抗原.就抗体制备而言,天然抗原的效果最好,运用反复冻融法、超声破碎法等直接从

肿瘤标本中分离抗原; 基因重组抗原是指将目的基因插入载体,在原核或真核系统中表达,获得相

应抗原; 合成性抗原是根据蛋白的氨基酸序列,通过抗原表位分析找到抗原性好的多肽片段,通过

固相合成制备抗原; 小分子半抗原分子量较小,免疫原性较弱,必须与载体连接之后才能产生免疫

应答反应.

制备出的抗原,根据性质可分为颗粒型抗原和可溶性抗原,可溶性抗原要添加佐剂增强免疫原性.

从纯度上来说,虽然要求不高,但高纯度的抗原能提高抗体获得的可能性.目前纯化抗原的定性鉴

定的常用方法有亲和层析法、双向免疫扩散、免疫电泳及聚丙稀酞胺凝胶电泳等.纯化蛋白质浓

度的定量测定可用双缩脲法、酚试剂法或紫外光吸收法[ 14 ].

2.3 抗肿瘤单克隆抗体制备

2. 3. 1 杂交瘤技术

单克隆抗体制备的基本原理是, 致敏的B 淋巴细胞能分泌特异性抗体,但这些细胞不能在体外存

活. 骨髓瘤细胞可在体外大量繁殖的HGPRT 缺陷株,但不能分泌特异性的抗体.将小鼠的骨髓瘤

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摘要：

目前单克隆抗体药物研发的一般流程国家十二五规划中明确提出:增强新药创制能力,加快单克隆抗体药物的研究,重点开发治疗恶性肿瘤的抗体药物,突破生物技术药物产业化的技术瓶颈,开发自主知识产权产品,抢占世界生物技术制药的制高点.笔者主要总结了目前单克隆抗体药物研发的一般流程,为发现、降低研发技术风险提供参考.1背景与现状随着当前工业化、城市化、老龄化进程的不断推进,生态环境的恶化和生活压力的不断加大,恶性肿瘤的发病率越来越高.近20年来我国癌症有年轻化趋势,发病率和死亡率"三线"不断走高,每年新发肿瘤病例约为312万例,平均发病率为285.91/10万,平均每分钟有6人被诊断为恶性肿瘤.恶性肿瘤的严重...

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